复方调理颗粒与单方混合临床用量分析

文小燕 许国清 陈伟英 容丽英

月经不调为妇科临床实践中常见症状，易导致妇女内分泌紊乱、生育功能受损等状况[1-3]。中医经典理论将该症状归类为热症、血瘀、虚热等，多以服用汤药或中成药调理为主，辅以食疗或心理治疗等手段[4-5]。复方调理颗粒系笔者所在单位基于经典方开发的医疗机构中药制剂，由白术、当归、巴戟天、党参等药味组成[6]。传统汤剂采用中药饮片煎水或单味药配方颗粒混合冲调，便利性和质量均一性较差[7-8]。复方调理颗粒将系各药味在制剂室统一混合煎煮，制作规范、便利患者。为研究该制剂与传统方法存在的差异，本研究拟建立科学、全面、适宜的检测和评价方法。

1 仪器、试药和材料

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪（美国），配备PDA 检测器，昆山KQ3200 超声仪（中国），Mettler-Toledo 精密电子分析天平（瑞士）。

1.2 试剂、试药和材料

色谱分析所用甲醇、磷酸为色谱纯，购自Honeywell 公司（美国），实验用纯净水购自Watsons 公司（中国）；白术内酯Ⅰ（批号080100-201507）和藁本内酯（批号101759-201206）对照品购自中国食品药品检定研究院（中国）；单味药配方颗粒购自广东一方制药股份有限公司（中国），制备复方颗粒所用药材购自广东康美药业股份有限公司（中国）。复方调理颗粒为本单位自制。

2 方法与结果

2.1 供试品制备

复方颗粒供试品的制备方法为，取复方调理颗粒1.0 g，精密称定，精密加水25 mL，稍加热使溶解，所得溶液放冷后，加乙酸乙酯萃取两次，每次20 mL；合并乙酸乙酯液，挥去溶剂，残渣精密加入甲醇25 mL使溶解，以0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

单味药配方颗粒混合汤剂供试品制备方法为，取各处方量各药味配方颗粒，加水400 mL 使溶解，精密量取所得溶液50 mL，自“加乙酸乙酯萃取”其制备供试品溶液，即得。

2.2 对照品制备

精密称取白术内酯Ⅰ和藁本内酯对照品适量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇适量溶解并定容至刻度，即得上述两种对照品溶液含量均为500 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 色谱条件

使用Dikma C18 色谱柱（4.6×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%磷酸（B）为流动相，梯度洗脱（程序见表1），流速1.0 mL/min，检测波长214 nm，柱温30℃，进样量10 μL。见表1。

表1 色谱条件表

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取白术内酯Ⅰ和藁本内酯对照品溶液适量，分别置于不同10 mL 量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，即得两种对照品浓度均为10、20、50、100、200、500 μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，按“2.3”项下方法进HPLC 分析，记录峰面积，以峰面积为纵坐标y，浓度为横坐标x，代入excel 软件中进行线性回归。结果显示，白术内酯Ⅰ的回归方程为y=1 141.7x-1 597.9（r2=0.999 8），藁本内酯的回归方程为y=2 224x -11 024（r2=0.999 2），表明方法线性关系良好，能够在10-500 μg/ml 范围内对白术内酯Ⅰ和藁本内酯进行准确定量。

2.4.2 精密度考察 取供试品溶液，按“2.3”项下方法进HPLC 分析，记录峰面积，计算RSD，结果显示，白术内酯Ⅰ和藁本内酯峰面积的RSD 分别为1.70%和0.47%，表明方法精密度良好。

2.4.3 提取回收率考察 取同一批复方调理颗粒（TL002）0.5g，按表3-1、3-2 所述最终浓度加入术内酯Ⅰ和藁本内酯对照品溶液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法进HPLC 分析，记录白术内酯Ⅰ和藁本内酯峰面积，计算二者的含量、回收率和RSD。结果显示，白术内酯Ⅰ的平均回收率为101.07%，RSD 为2.82%；藁本内酯的平均回收率为99.11%，RSD 为3.38%。结果表明，方法准确度良好。

2.4.4 稳定性考察 取供试品溶液，置于自动进样器中，分别于0、2、4、6、8、12 小时按“2.3”项下方法进HPLC 分析，记录白术内酯Ⅰ和藁本内酯峰面积，计算二者的含量和RSD。结果显示，白术内酯Ⅰ含量的RSD 为2.02%，藁本内酯含量的RSD 为0.46%，表明本研究所制备供试品溶液稳定性良好。

2.5 复方调理颗粒和单味药材颗粒方剂的临床用量比较研究

取10 批复方调理颗粒，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法进HPLC 分析；另取方中各药味配方颗粒适量，共取10 剂，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3”项下方法进HPLC 分析；记录上述溶液中白术内酯Ⅰ和藁本内酯峰面积，计算二者的含量和RSD。结果显示（表3-1、3-2），复方颗粒中白术内酯Ⅰ的平均含量为0.325 mg/g；藁本内酯的平均含量为0.817 mg/g。经过等量换算，可知以白术内酯Ⅰ计，复方颗粒的临床用量相当于单味药材配制汤剂的109.93%；以藁本内酯计，复方颗粒的临床用量相当于单味药材配制汤剂的94.86%。

3 讨论

调理方的君药为当归，臣药为白术。传统的医疗机构中药制剂研究，除制剂检查项外，对方中各药味仅要求建立薄层色谱鉴别方法[9-10]。上述方法存在如下缺陷：一是仅包含鉴别项无法准确反映方中各药味特别是主要药味（如君、臣药）的含量差异，无从比较不同方法、不同批次药材制备的汤剂之间的差异；二是汤剂本质为以水为溶剂制备提取物，薄层色谱鉴别方法用于指标的斑点可能并不是该药味发挥功效主治的成分，不能准确表征药效。因此，在临床用量研究中，指标性成分应包括上述两种药味中与功效主治相关的成分，同时应建立基于仪器分析的上述指标性成分含量测定方法，用于准确评价功效差异。文献调研结果显示，白术内酯Ⅰ具有抗氧化和抗衰老的作用，能够抑制细胞凋亡[11-13]；藁本内酯为当归中的重要化学成分，除改善微循环，舒张血管作用外，也具有较好的抗氧化和抗衰老活性；同时，藁本内酯对循环系统的调理，能够较好地改善女性月经不调的症状[14-15]。因此，选择上述两种成分作为指标，较为贴近调理方的功效主治。

表2 白术内酯Ⅰ回收率测定结果

表3 藁本内酯回收率测定结果

表3-1 复方和单方混合汤剂中白术内酯Ⅰ转移率

表3-2 复方和单方混合汤剂中藁本内酯转移率

本研究测定的两个成分色谱峰周围均存在其它色谱峰，经过反复优化，能够基本实现基线分离。根据优化过程中上述色谱峰间分离度、峰型和峰宽等参数推断，这些成分可能是与目标成分结构相似的物质，且部分成分含量与目标成分相近。上述结果提示，在调理方中，可能含有更多具有类似活性的成分。

根据临床用量分析结果可知，复方调理颗粒与单味药材配制的调理方汤剂相比较，其实际临床用量并无显著性差异（p＜0.05），表明复方调理颗粒可以在临床应用中替代配方颗粒所配制的方剂。此外，由于前者系复方颗粒，可以大大节省药方配药和患者冲服的难度，提高药物的使用效率。同时，采用全方进行标准化提取和制粒，相较单味药配方颗粒而言质量更为可控，最终所得汤剂也较为稳定。

本研究采用复方调理颗粒与单味药配方颗粒配制的方剂进行临床用量比较研究，显示前者对后者具有较好的替代性。所用分析方法快速、准确、高效，能够为后续复方调理颗粒的开发提供研究经验和科学依据。