新型鹅细小病毒研究进展

卞国志，马海彬，罗梦萍，龚凤平，王贵平，廖 明，袁建丰

（1.华南农业大学兽医学院， 广州510642 ；2.广东海大畜牧兽医研究院有限公司， 广州 511400）

1956年我国首次报道发现小鹅瘟，并于1961年分离得到该病的病原体鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）[1]。而番鸭细小病毒病最早于1980年在我国出现，1993年由程由铨等[2]首次分离到番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）。GPV和MDPV引起的鸭细小病毒病呈全球流行，欧洲、东南亚、美洲等地区都有该病的报道[3-4]。经典GPV毒株可感染雏鹅和雏番鸭，MDPV只感染雏番鸭[4]，但是两者都不感染樱桃谷鸭。

新型鹅细小病毒（Novel Goose Parvovirus，N-GPV）典型的临床症状为软脚、短嘴和生长障碍[5]。Villatte报道1971年该病症首次出现在法国西南部的半番鸭群中，另外1995年和2009年分别在波兰和匈牙利爆发[6]。国内最早于1989年台湾报道了1例由N-GPV和鸭肝炎病毒混合感染的病例[7]。N-GPV引起的细小病毒病在大陆最早出现在2008年，但是并未引起足够重视[8]。2015年福建部分地区的半番鸭爆发此流行病，随后陆续在山东省、河北省、河南省、安徽省和江西省的半番鸭和樱桃谷鸭中出现，该病发病率10%～30%，病死率一般低于3%，僵鸭淘汰率高达80%，造成养鸭业巨大经济损失[9]。

1 病原学特征

1.1 形态MDPV和GPV属于细小病毒科（parvoviridae）细小病毒亚科（parvovirinae）依赖病毒属（Dependovirus），为单股链状DNA病毒[10-12]。在电镜下MDPV和GPV病毒粒子分为实心和空心两种形态，直径为20～24 nm，无囊膜，正二十面体对称，衣壳由32个管桩排列的壳粒构成[13]。MDPV与GPV在病毒大小、形态、基因组结构等都很相似，发病症状也很相似[10]。

1.2 基因组MDPV、GPV和N-GPV的基因组序列差别不大，各分离株都在5.1 kb左右[14-16]。三者基因组都包括2个开放阅读框，左侧开放阅读框（left open reading frame，LORF）编码非结构蛋白，右侧开放阅读狂（right open reading frame，RORF）编码结构蛋白。非结构蛋白有2个，分别为NS1和NS2，肽链长度NS1＞NS2，并且共用一个终止密码子。结构蛋白有3个，分别为VP1、VP2和VP3，肽链长度VP1＞VP2＞VP3，也具有同一个终止密码子。LORF和RORF间隔18 nt。

非结构蛋白（non-structural protein，NS）重要功能为参与病毒复制和转录的调节[17-18]。其中NS1参与病毒复制，并有结合ATP和抑制宿主细胞DNA复制等功能[19]。NS2对NS1的功能有促进作用，此外NS2蛋白还可能与病毒增值以及DNA合成相关[18]。

结构蛋白VP是病毒衣壳的组成成分，MDPV结构蛋白VP1、VP2、VP3大小分别为91、78、58 kDa。N-GPV和GPV结构蛋白VP1、VP2、VP3蛋白大小分别为87、70、60 kDa。MDPV、GPV和N-GPV的VP2蛋白是其主要免疫原性蛋白。与VP2蛋白相比，VP1、VP3蛋白的免疫原性较弱。

MDPV、GPV和N-GPV的基因组5'端均折叠形成发夹结构（图1），发夹结构呈“箭”形，两端存在着相同的末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），长度约为440 bp，发夹结构和ITR对病毒的复制起重要作用[20]。发夹结构有约180 nt的“茎”部和45 nt的“泡”区构成。“箭”头上有限制性内切酶SphI的酶切位点，是ITR的对称中心。ITR含有多个4～10 bp的重复序列，如TTCCGG及其衍生体重复了18次。在复制过程中ITR或发夹结构起到至关重要的作用。

图1 MDPV和GPV病毒基因序列图Fig.1 Genetic map of MDPV and GPV

1.3 核苷酸序列通过对2015年N-GPV爆发以来的7株分离株全基因组核苷酸序列比对分析发现，不同N-GPV的分离株全基因序列相似性为99.2%～99.7%。与2012年分离的经典GPV LH株全基因组核苷酸相似性为93.4%～95.2%。与2015年分离的MDPV P1株全基因组核苷酸相似性为81.3%～83.4%，见图2。

图2 全基因组核苷酸序列比对Fig.2 Genome nucleotide sequence comparison

通过对2015年N-GPV爆发以来的7株分离株非结构蛋白核苷酸序列比对分析发现，不同N-GPV的分离株非结构蛋白序列相似性为99.1%～99.9%。与2012年分离的经典GPV LH株非结构蛋白核苷酸相似性为96.2%～96.4 %。与2015年分离的MDPV P1株非结构蛋白核苷酸相似性为81.7% ～82.9%，见图3。

图3 非结构蛋白核苷酸序列比对Fig.3 Non-structural protein sequence comparisons

通过对2015年N-GPV爆发以来的6株分离株结构蛋白核苷酸序列比对分析发现，不同N-GPV的分离株结构蛋白序列相似性为99.6%～99.9%。与2012年分离的经典GPV LH株结构蛋白核苷酸相似性为94.7%～95.0 %。与2015年分离的MDPV P1株结构蛋白核苷酸相似性为80.4%～ 81.1%，见图4。

图4 结构蛋白核苷酸序列比对Fig.4 Structural protein sequence comparisons

1.4 N-GPV关键突变位点分析VP2蛋白是决定病毒结合位点和宿主特异性的关键因素[21]。其结构和氨基酸同源性分析证实N-GPV QH15株的VP2 3个不同表面位点（392、430和558位氨基酸）在GPV和MDPV中是有区别的。MDPV分别为I392、L430、N558或L392、K430、N558，GPV为L392、K430、D558，而N-GPV QH15株、GPV a2006株、GPV 1995株为I392、R430、N558，与MDPV和GPV都不同。暗示有可能是这些位点的变化导致GPV能在樱桃谷鸭、半番鸭体内复制并且致病[22]。

通过和其他GPV序列比对发现N-GPV SDLC01株的REP基因32位氨基酸由Asn替代了Ser，进而影响了磷酸酯酶A2（phospholipase A2，PLA2）的催化区域和活性，从而导致钙磷代谢的异常，导致骨发育异常，特别表现在喙、跖骨和翅骨。喙是由多个突出面组成，随着鸭的生长，这些突出面共同组成鸭喙。喙的额鼻处有2个增生区域，这些区域和骨形成蛋白4有关。可能是由于病毒感染导致骨形成蛋白4活性改变，导致鸭喙形状的改变[6]。

2 致病特征

2.1 临床症状N-GPV引起的病鸭临床症状为舌头肿胀、腹泻、胫骨变短，此外还有喙变短，舌头突出，生长障碍等[9]（图5）。而典型的MDPV和GPV引起的鸭细小病毒病临床症状按照发病情况分为最急性、急性和亚急性。最急性：多发生于6日龄内番鸭，病程数小时，几乎不出现前期症状就死亡，临死前病鸭头颈朝一侧弯曲，两脚呈游泳状；急性型：多发生7～14日龄番鸭，病程2～4 d，前期症状为不同程度腹泻、呼吸困难、两脚无力、厌食；亚急性型：多发生14日龄以上的雏番鸭，病程5～7 d，症状与急性型相似，病死率较低[23]。比较发现N-GPV与典型细小病毒病的区别为喙变短，舌头突出，具有很好的区分度。

图5 N-GPV引起的病鸭典型症状Fig.5 Typical symptoms caused by N-GPV

2.2 剖检特点感染N-GPV后的病鸭舌头出现间质性炎症，舌部的结缔组织疏松、水肿；胸腺出血、水肿，并有坏死点；肾小管存在出血、水肿和炎性细胞浸润，肝脏轻微萎缩，胸腺肿胀和出血，其他器官无特征性病变[14]。而感染经典GPV和MDPV的番鸭细小病毒病特征性病理变化为渗出性肠炎和胰脏坏死，另外还包括肠粘膜充血出血，胰脏苍白，表面有灰白色坏死点，胆囊肿大，心肌束间有红细胞渗出，血管扩张，肝细胞局部有颗粒变性和脂肪变性，神经细胞轻度变性，胶质细胞轻度增生[1-2,24-25]。

与GPV和MDPV引起的症状相比，N-GPV的病理学变化更轻微，对组织的损伤相对较小。比较发现，3种毒株造成鸭群的发病率差异不显著，但病死率差别很大。

3 流行病学

N-GPV感染宿主为樱桃谷鸭和半番鸭，该病发病率10%～30%，病死率一般低于3%，僵鸭淘汰率高达80%[26]。GPV是小鹅瘟的病原，易感染4～20日龄的雏鹅和雏番鸭[1,27]。雏番鸭爆发典型GPV的发病率为50%～70%，病死率40%～65%。MDPV仅能感染番鸭并使之发病，并不能感染麻鸭、半番鸭、北京鸭、樱桃谷鸭、鹅等，三周龄内发病率40%～60%，死亡率20%～40%[4,28]。

表1 引起鸭细小病毒病的毒株比较Table 1 Comparison of virus strains that causing duck Parvovirus disease

通过表1可以看出，N-GPV不仅和经典GPV和MDPV在宿主方面有很大差别，并且发病率相对较低，死亡率更是远远低于GPV和MDPV引起的鸭细小病毒病。不过，这些毒株对鸭群的危害都集中在三周龄内的雏鸭。

4 培养特性

MDPV初代分离只能用番鸭胚，病毒适应鸭胚后，才可以在鹅胚中增值；GPV的分离培养能使用鹅胚和鸭胚，而N-GPV只能使用鸭胚分离，并不能在鹅胚中增值。GPV和MDPV接种鸭胚尿囊腔3～5 d后死亡，感染番鸭胚绒毛尿囊膜变厚，胚体充血，翅、头、趾等部位有出血点[29]。N-GPV毒性较弱，接种鸭胚后连续4代才会死亡，死亡鸭胚尿囊膜增厚和呈灰色[30]。

番鸭胚成纤维细胞（muscovy duck embryo fibroblast cell，MDEFC）和番鸭胚肾细胞（muscovy duck embryo kidney cell，MDEKC）可用来增值MDPV。MDPV适应细胞后，产生细胞病变和包涵体，形成蓝色小噬斑。鹅胚或鸭胚成纤维细胞感染GPV 3～5 d后，出现明显的细胞病变，表现为细胞变大、细变圆和脱落。连续DEF细胞传代N-GPV第4代才能发现明显的细胞病变，新型鸭源鹅细小病毒能在DEF中培养，而不能在鸡胚成纤维细胞中增值[16]。

5 免疫学实验

凝集实验（latex agglutination，LA）表明新型鸭源鹅细小病毒和GPV抗原反应阳性，与MDPV抗原反应阴性。凝集抑制实验（latex agglutination inhibition，LAI）表明患N-GPV病鸭对MDPV和GPV抗体都是血清反应阳性，不过GPV抗体滴度（25.0～29.6）明显高于MDPV抗体滴度（22.2～26.4）。N-GPV病毒回归实验发现雏鸭感染后7 d，部分对GPV抗体血清反应阳性，感染后14～42 d全部攻毒鸭对GPV抗体血清反应阳性[30-31]。

6 总结

目前，新型鹅细小病毒的感染范围已经扩散到了北京市、山东省、河南省、河北省、江苏省、浙江省、安徽省、湖北省、上海市、福建省、广东省和广西壮族自治区等12个省市区，而这些地区正是养鸭业的主产区。尽管N-GPV造成的死亡率不高，但耐过鸭由于生长障碍和畸形严重降低了其市场价值及经济效益，给养鸭业造成了巨大损失。

虽然我国2008年就出现了新型鹅细小病毒病，但2015年以前并未大区域爆发，分析可能原因是2015年该病毒发生了突变，导致其传播能力突然增强，但也不排除大规模养殖模式对该病毒传播的影响。目前典型的GPV疫苗仍可预防N-GPV的发生，但是该病毒仍在变异中，传统小鹅瘟疫苗和抗体可能面临失效的风险。

虽然该病自2015年爆发以来，国内科研工作者都在研究其病原体来源、致病性、与其他毒株的差异性，但是其致病机理及演化过程还不清楚，需要进一步研究。本研究旨在分析N-GPV的遗传变异和与经典GPV、MDPV的区别，为今后该病的研究及防控提供详尽的技术支撑。