马泰勒虫新疆株EMA2基因的克隆及原核表达

张 杨，刘世芳，海尼木古力·艾合买提，王盼举，宋瑞其，巴音查汗

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.托克逊县夏乡畜牧业服务中心，吐鲁番 838100）

马泰勒虫病是由马泰勒虫（Theileria equi，T.equi）寄生于马、骡、驴等马属动物红细胞内而引起的一种原虫病，该病的传播媒介为硬蜱，如璃眼蜱和革蜱[1-2]，呈世界性流行，对全球马产业的危害严重[3-4]。临床上该病主要表现为发热、贫血、黄疸和水肿，严重时可导致流产和死亡[5-6]。据报道，我国马泰勒虫病主要流行于新疆维吾尔族自治区、黑龙江省、吉林省、辽宁省、内蒙古自治区、青海省以及南方的一些省地区。尤其是新疆地区马泰勒虫感染率较高[7]，其中伊犁地区马泰勒虫感染率为34.44%[8]；阿勒泰马匹马泰勒虫感染率为13.3%[9]；喀什地区驴感染马泰勒虫感染率为36.84%[10]；吉林省部分地区马泰勒虫病的阳性率为16.15%[11]；广州、东莞、深圳马泰勒虫病平均抗体阳性率为13.3%[12]；贵州省三个马群中马泰勒虫感染率为12.5%[13]。马泰勒虫病是全球兽医界、公共卫生及马产业领域普遍关注的焦点[14]。

裂殖子表面抗原是原生动物界普遍存在的一类高度保守蛋白，其中T.equi裂殖子表面抗原蛋白家族中研究较多的是EMA1、EMA2 和 EMA3[15]，EMA 蛋白含有一个糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosi-tol，GPI）锚定蛋白，被证实是蛋白与细胞膜结合的唯一方式，GPI锚定蛋白的C末端是通过乙醇胺磷酸盐桥接于核心多糖上，该结构高度保守，另有一个磷脂结构将GPI锚连接在细胞膜上[16]，在T.equi膜表面的GPI锚定蛋白能通过周期性的改变逃避宿主免疫[17]。国内外研究证明，EMA蛋白因其高度的保守性被作为马泰勒虫病ELSIA检测中运用最广泛的蛋白。Donald[18]曾通过原核表达，获得了EMA-1蛋白，用于CI ELISA。现阶段，马泰勒虫病的血清学检测方法多依赖于国外进口试剂盒，存在成本高昂，且耗时，国外虫株和国内流行虫株存在有一定差异性，在诊断的准确性方面还有待商榷。本试验拟构建T.equi新疆株EMA2基因原核表达载体，可为后续马泰勒虫病ELISA抗原检测方法和EMA2蛋白的功能及机制进一步深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 虫株、质粒和菌株T.equi新疆株由本实验室保存；pEASY-E1载体、大肠杆菌 DH5α、BL21细胞购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂全血、组织 DNA 提取试剂盒购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；TaqDNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DNA DL2000、胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒等均购于宝生物工程（大连）有限公司；Blue Plus Protein Marker、pEASY-T1克隆试剂盒、pEASY-E1表达试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；增强型 ECL 化学发光检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3 引物合成参照文献合成T.equiEMA2 序列特异性引物，上游引物F8：5'-TTTTACCCTCGCAT ACTTG-3'、下游引物R8：5'-GCCATAGACGG AGAACCC-3'，由北京鼎国生物技术公司合成。

1.4 基因组的提取及目的基因的扩增基因组的提取按照全血、组织提取试剂盒说明进行，-20℃保存备用。虫体总核酸为模板，进行 PCR 反应。反应体系（50 μL）：10×PCR缓冲液5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，rTaq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物（10 pmol/L）各1.5 μL，加DEPC水至50 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃ 变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸5 min。取5 μL PCR 产物，于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 重组表达载体pEASY-E-TE的构建及鉴定使用胶回收试剂盒回收PCR产物，与pEASY-E1载体连接后转化至BL21感受态细胞，涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp+的LB琼脂平板上37℃过夜培养，挑取白色单菌落，接种于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB中振摇培养，提取重组质粒，命名为pEASYE-TE，并送至生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 目的蛋白的诱导表达将含有重组质粒pEASYE-TE菌液按照1∶100接种于含有抗性的LB液体培养基中，pEASY-E1空载体同步转化至BL21感受态细胞作对照，37℃振荡培养，当OD600达到0.6时，加入IPTG进行诱导，SDS-PAGE检测。

1.7 目的蛋白的Western blot分析将SDS-PAGE分离的条带转印到PVDF膜上，用T.equi阳性血清（1∶200）作为一抗，HRP标记的兔抗马IgG（1∶5000）为二抗，加入ECL化学发光检测试剂盒，X光曝光，显影，定影后分析结果。

2 结果与讨论

2.1 T.equi EMA2基因的扩增与重组表达载体pEASYE-TE 的构建及鉴定以T.equi全基因组为模板，用特异性引物进行PCR扩增，经凝胶电泳检测，获得了约819 bp的特异性 DNA 片段（图1），与预期的片段大小相一致。构建的重组表达载体pEASY-ETE的测序结果通过Blast比对，与Genbank中T.equi裂殖子表面抗原2的mRNA（GenBank登录号：XM004831448.1）高度同源。

图1 EMA2基因PCR扩增产物Fig.1 PCR-ampli fied EMA2 gene

2.2 目的蛋白的原核表达与鉴定重组表达载体pEASY-E-TE和空载体pEASY-E1经IPTG诱导5 h，SDS-PAGE 检测结果显示，表达载体在约35 kDa处有1条明显的表达带，与预期的重组蛋白大小相符，获得的重组蛋白命名为rEMA2而空载体无相应条带（图2）。真核生物的基因绝大多数是断裂基因，有外显子和内含子，基因被表达出来后，内含子被切除，外显子连接在一起，成为成熟mRNA，即可以进行翻译蛋白质。在部分原生动物中的某些基因中是不含内含子的，通过扩增马泰勒虫的EMA2基因，构建原核表达载体并纯化重组蛋白，也反映出马泰勒虫裂殖子表面抗原基因不含内含子序列。

图2 重组蛋白rEMA2的SDS-PAGE表达结果Fig.2 SDS-PAGE results of rEMA2 expression

2.3 重组蛋白rEMA2的Western blot分析免疫印迹结果显示表达的重组rEMA2蛋白在约35 kDa出现特异性条带（图3），表明构建的重组蛋白具有较好的反应原性。Kumar等[19]表达了EMA1和EMA2蛋白，大小分别为34 kDa和30 kDa，而本实验所表达的EMA2蛋白的大小约为35 kDa。EMA2 蛋白作为T.equi自身高度保守的蛋白之一，其表面GPI锚定蛋白对于T.equi入侵宿主细胞及逃避宿主免疫等相关入侵机制机理至关重要，故重组蛋白rEMA2为后续进一步探索 EMA2 靶基因及其相关研究奠定基础。

图3 重组蛋白rEMA2 Western blot分析Fig.3 rEMA2 of Western blot analysis