基于pcox1基因分析黑斑蛙小吻对盲囊线虫种系发育关系

李巧燕，谭子龙，靳元春，何 鑫，柳亦松，刘 伟

（1.湖南省郴州市资兴市畜牧兽医水产局，郴州 423400；2.易联生物科技有限公司，广州 510623；3.湖南农业大学动物医学院，长沙 410128）

小吻对盲囊线虫（Contracaecum osculatum）是属于异尖科的寄生线虫，其中间宿主可为多种甲壳类动物，主要寄生在目鱼、鳕鱼、海豚等海洋哺乳动物体内，同时也可感染其他捕食鱼类（包括人类）的哺乳动物[1-3]。小吻对盲囊线虫感染人的报道较少，以第三期幼虫为主，通过寄生于人体消化道各部位，引发内脏幼虫移行症，导致宿主胃肠不适，感染严重者表现为进食后数小时腹部突发剧痛，对人类健康具有潜在危害[4-5]。因此，正确鉴别小吻对盲囊线虫，不仅具有重要学术价值，对该病的预防和社会公共卫生也具有重要意义。

传统的寄生虫鉴定方法主要依据是形态学鉴定，但随着时间的推移和生物种群的进化，形态学鉴定局限性愈加明显，即难以对相似种和近缘物种进行准确的鉴别[6]。随着分子生物学的发展，选择合适的基因作为标记可以更好的探究寄生虫的遗传变异情况，为此问题的解决开辟了新的途径[7-8]。线粒体DNA（mtDNA）是一种核外遗传物质，与核DNA相比，具有分子量小、结构简单、进化速率快、母系遗传等优点，近年来越来越多的被学者应用于寄生虫的种类鉴定和遗传发育关系研究[9-10]。本研究以湖南省不同地区黑斑蛙体内采集到的小吻对盲囊线虫分离株为研究对象，利用PCR方法对其pcox1基因序列进行扩增和序列分析，从而明确小吻对盲囊线虫线粒体pcox1基因序列能否成为理想的种间遗传标记，为小吻对盲囊线虫的分类鉴别和分子流行病学调查等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体样品16个黑斑蛙小吻对盲囊线虫样品分别采自湖南省常德（CD1-2）、溆浦（XP1-2）、宜章（YZ1-2）、张家界（ZJJ1-2）、株洲（ZZ1-2）、耒阳（LY1-2）、长沙（CS1-2）、邵阳（SY1-2），所采集样品均来自于黑斑蛙胃部。

1.2 主要试剂Taq酶及相关试剂购自TaKaRa公司，蛋白酶K购自Merck公司，WizardTMDNA Cleanup System试剂盒购自Promega公司，基因组DNA提取试剂盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）购自Promega公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。

1.3 样品保存及形态学鉴定取样品放入0.9%生理盐水中，让虫吐出食道中的残余物。从所采取的虫体中选择几条形态完整虫体保存入甘油溶液中，其余的全部放入70%的酒精中保存备用。完成线虫乳酸甘油透明步骤，将制作好的标本放在显微镜下进行观察，根据虫体的头部、尾部形态来确定虫的种类。参考相关文献[11]，进行初步形态学鉴定。

1.4 样品DNA的制备每个成虫截取虫尾一小段，用ddH2O反复冲洗4次，分别置于1.5 mL离心管中，用灭菌的微型剪刀将虫体剪碎，分别加入30 μL蛋白酶K（50 μg/μL）和270 μL SDS裂解液，混匀后置于55℃恒温培养箱中过夜消化。用Promega公司的DNA抽提试剂盒提取虫体DNA，置于-20℃保存备用。

1.5 目的DNA片段扩增利用DNA提取试剂盒提取70%酒精保存的小吻对盲囊线虫基因组DNA，以其为模板，按照文献[12]等设计合成的1对引物（上游引物：5'-TTTTT TGGGC ATCCT GAGGT TTAT-3'，下游引物：5'-TAAAG AAA GA ACATA ATGAA AATG-3'）进行cox1基因片段的PCR扩增。反应体系为50 μL；扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，预期扩增片段约为400 bp。

1.6 cox1基因片段序列测定和序列分析PCR扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司直接测序，利用DNAStar 5.0软件进行分析，并与GenBank中登录的代表性小吻对盲囊线虫cox1序列进行比较，利用Clustal X2.0及Mega 4.1软件对扩增的cox1序列进行比对，并利用Mega 4.1程序中的临接法（Neighbor-joining method，NJ）构建种系发育树。临接法在软件默认设置下进行分析；同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行序列相似性分析。

2 结果与讨论

2.1 形态学鉴定前唇瓣具双叉的齿状嵴，间唇付缺；食道具有长方形的腺质的后端膨大，无膨大部的突起或盲肠；雄虫尾部钝圆、锥形，有许多肛前乳突和数对肛后乳突，交合刺等长或不等长；雌虫阴门位于体前部，卵较小（图1）。基于上述形态学特点，初步判定湖南省8个地区16个样品为同一物种，初步定为小吻对盲囊线虫。

图1 小吻对盲囊线虫形态学Fig.1 The morphology of Contracaecum osculatum

2.2 PCR扩增结果及序列分析对16个黑斑蛙小吻对盲囊线虫样品中8个代表性样品均成功地扩增出约400 bp pcox1的条带，与预期目的片段大小一致，且无非特异性条带，阴性对照未扩增出条带（图2）。

图2 小吻对盲囊线虫线粒体pcox1 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig.2 Ampli fication of mtDNA pcox1 gene fragment from frog Contracaecum osculatum by PCR

扩增产物测序结果显示，湖南省的16个分离株cox1基因扩增序列均为394 bp。样品序列与GenBank中收录的小吻对盲囊线虫pcox1基因序列（GenBank登录号：AJ405310.1）进行比较，相似性为92.1%～93.4%，其中样品CD-1、CD-2、XP-1、XP-2、ZZ-1、ZZ-2、LY-1、LY-2与其相似度最高，为93.4%。与肝片吸虫（GenBank登录号：GU112485.1）、类圆线虫（GenBank登录号：AB526290.1）进行种间比较，相似度则较低，为32.1%～53.2%。

2.3 pcox1基因序列系统发生树利用NJ法构建系统发生树（图3），结果显示，16个黑斑蛙小吻对盲囊线虫分离株与GenBank上报道的小吻对盲囊线虫（GenBank登录号：AJ405310.1）位于同一支，小吻对盲囊线虫分离株与其他线虫所属分支相隔较远，能够十分明显的区分开来，系统发生树中的Bootstrap值较高，得到了很好的鉴别。

图3 基于pcox1基因序列构建的系统进化树Fig.3 Bootstrap consensus phylogram of the stationary tree reconstructed by NJ using the pcox1 sequences

本研究通过对湖南省不同地区蛙体内小吻对盲囊线虫16个样品的pcox1基因序列分析发现，与已报道的小吻对盲囊线虫序列的相似度为92.1%～93.4%；将小吻对盲囊线虫的16个样品的pcox1序列进行种内比较，发现其种内差异为6.6%～7.9%，而种间的差异为46.8%～67.9%；蛙体内的小吻对盲囊线虫mtDNAcox1基因序列的种间差异大于种内差异。从以上结果可以初步判断蛙小吻对盲囊线虫线粒体pcox1基因序列可作为分子遗传标记用于其种（株）之间的分类和鉴定。

对所获得的小吻对盲囊线虫的序列进行了系统进化分析，发现湖南省黑斑蛙小吻对盲囊线虫16株分离株与GenBank上报道的小吻对盲囊线虫属同一枝。从分子进化的角度看，与我们的形态学分类结果完全一致。同时也进一步说明mtDNAcox1基因序列可作为蛙小吻对盲囊线虫（株）之间的分类和鉴定的分子遗传标记。

本试验阐明湖南省8个地区黑斑蛙小吻对盲囊线虫序列的进化与变异情况，填补了相关研究的空白，并利用计算机模型进行了差异性分析和系统进化分析，为下一步黑斑蛙寄生虫病、分子遗传学和诊断学研究奠定基础，同时也为其他寄生虫病研究提供了方法学参考。