两种测定信阳茶叶中咖啡碱含量的方法比较

余艳芳，王晓，刘厚红，郭建峰

两种测定信阳茶叶中咖啡碱含量的方法比较

余艳芳，王晓，刘厚红，郭建峰

（信阳市文新茶叶有限责任公司，河南信阳 464000）

茶咖啡碱测定GB/T 8312-2013给出了紫外分光光度法和高效液相色谱法两种检测方法，本研究采用以上两种方法分别测定了不同经历贮存期的信阳毛尖茶和信阳红茶的咖啡碱含量。结果显示，高效液相色谱法相对于紫外分光光度法测得的咖啡碱含量下降了近16%，且信阳毛尖茶和信阳红茶下降比例相当。同时，由于生产工艺不同，信阳红茶中咖啡碱含量总高于信阳毛尖茶。紫外分光光度法测得的咖啡碱含量偏高，因为包含了与其结构类似的其它嘌呤碱类物质。另外，若采用紫外分光光度法完全依照国标测得样品的吸光度大于0.7，为保证结果的准确性，须将第一步反应试液用量减半。

紫外分光光度法；高效液相色谱法；咖啡碱；信阳毛尖茶；信阳红茶

咖啡碱又名咖啡因，是茶叶主要功能成分之一，具有提神益思、缓解疲劳、强心、利尿的作用，它可溶于水，是形成茶汤滋味的重要物质。纯咖啡碱是白色的，强烈苦味的粉状物，茶叶中咖啡碱的特点是苦而不回甘。茶汤中咖啡碱能与儿茶素、茶黄素形成络合物，从而提供了具有一定刺激性而又较为协调的爽口感。咖啡碱含量是目前许多国内、国际贸易对茶叶质量评价的一项重要指标，所以对茶叶中含有的咖啡碱进行准确测定是非常必要的。以往咖啡碱测定主要采用重铬酸钾滴定法、薄层色谱法、近红外光谱法、分光光度法、液相色谱法、

1 材料

茶叶样品

毛细管电泳茶样均来自信阳市文新茶叶有限责任公司，信阳毛尖选择2015至2018年的A100绿法、质谱法等[1]。国家标准GB/T 8312-2013采用的是紫外分光光度法或高效液相色谱法[2]。由于两种方法依据的原理不完全一致，在测定咖啡碱含量时可能有所差异，因此本研究通过实测信阳毛尖和信阳红中咖啡碱含量，进而比较两种方法测定结果的一致性。茶，共4个样品；信阳红选择2015至2018年的H100红茶，共4个样品。

茶样一直贮存于温度0~5℃的保鲜库中，2015~2017年的茶样为保鲜库中的往年留样。

仪器

高效液相色谱仪（LC-2010A HT岛津），双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），分析天平（沈阳神宇龙腾天平有限公司），数显恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂），循环水式真空泵（上海凌科实业发展有限公司），普力菲尔超纯水机（上海富诗特仪器设备有限公司），微型植物试料粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）。

试剂

咖啡碱标准品（≥99%，上海源叶生物科技有限公司），甲醇（GR，天津市科密欧化学试剂有限公司），氧化镁（重质AR，天津市科密欧化学试剂有限公司），碱式乙酸铅（AR，上海山浦化工有限公司），浓盐酸（AR，西陇科学股份有限公司），浓硫酸（AR，开封市芳晶化学试剂有限公司）。

2 方法

参照GB/T 8312-2013茶咖啡碱测定，第一法高效液相色谱法和第二法紫外分光光度法。

2.1 高效液相色谱法

咖啡碱标准液、分析原料的制备、测定、标准曲线制作和结果计算方法完全依据GB/T 8312-2013“3.1原理~3.5结果计算”进行。其中，高效液相色谱仪配备紫外检测器，采用C18（ODS柱），检测波长280nm；流动相为V甲醇:V水=3:7的混合液，过0.45μm膜，超声波脱气后使用；流速1.0ml/min，柱温40℃，进样量10μL。

2.2 紫外分光光度法

试剂和溶液配制、试液制备、咖啡碱标准曲线的制作完全依照GB/T 8312-2013执行。试液测定相比国标有所改动，操作如下：用移液管准确吸取5ml试液至100ml容量瓶中，加入4ml 0.01mol/l盐酸和1ml碱式乙酸铅溶液，用水定容至刻度，混匀，静置澄清过滤。准确吸取滤液25ml，注入50ml容量瓶中，加入0.1ml 4.5mol/l硫酸溶液，加水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤。用10mm石英比色杯，在波长274nm处以试剂空白溶液作参比，测定吸光度（A）。

咖啡碱含量计算公式也根据试液实际用量相应调整。

3 结果与分析

3.1 GB/T 8312-2013标准曲线的建立

3.2 不同测定方法对信阳毛尖和信阳红茶中咖啡碱含量的影响

表1 HPLC和UV法测得供试茶样中咖啡碱含量

注：A100为同等级的信阳毛尖、H100为同等级的信阳红。

3.3 信阳毛尖和信阳红茶中咖啡碱含量比较

图6 咖啡碱“信阳毛尖茶”试样特征谱图

图7 咖啡碱“信阳红茶”试样特征谱图

3.5 结果分析

采用GB/T 8312-2013中的两种方法分别测定相同级别不同经历贮存期的信阳毛尖和信阳红茶中咖啡碱含量。由表1可知，对于不同年份的信阳毛尖样品，HPLC法测得咖啡碱含量为3.90%~4.60%，而紫外分光光度法测得咖啡碱含量为4.83%~ 5.33%，HPLC法测得的平均含量下降了15.8%。对于不同年份的信阳红茶样品，HPLC法测得咖啡碱含量为4.92%~5.49%，而紫外分光光度法测得咖啡碱含量为6.01%~ 6.48%，HPLC法测得的平均含量下降了15.7%。由实验结果可知，高效液相色谱法相对于紫外分光光度法测定的咖啡碱含量下降了近16%，绿茶和红茶下降比例相当。

由图3~4知，信阳红中咖啡碱含量高于信阳毛尖。因为一方面红茶是通过发酵加工制作而得，而绿茶没有经过发酵，相关研究显示茶叶发酵时间越长，咖啡碱含量就会越多，相同原料制成的红茶咖啡碱含量普遍高于绿茶[3~6]；另一方面，咖啡碱在温度达到178℃时开始变为气体升华，文新信阳毛尖经杀青、生锅、熟锅炒制而成，相关研究显示从鲜叶采摘到炒茶工序咖啡碱含量变化相对较大，不断降低[7]，而红茶不经过以上工序，这也是红茶咖啡碱含量高于绿茶的原因之一。

对比2015~2018年相同级别的同种茶叶，咖啡碱含量与保存年限之间无明显相关性。因为不同年份间气候不同，供试茶样的采摘日期也不完全相同，采摘期茶叶品质是一个动态变化过程[8]，因此供试茶样本身咖啡碱含量不完全一致。茶咖啡碱含量与茶树生长代谢有着密切关系，茶叶新梢哪里生长旺盛，哪里的咖啡碱含量越多[9]；茶树哪个时期长得快，哪个季节的咖啡碱含量越多，夏茶比春茶含量高[10]。

4 小结与讨论

两种方法均为水溶液提取，它具有无毒、挥发性小、可操作性强的特点。

用HPLC法测定茶叶中咖啡碱含量，操作简单，快速、准确。因为HPLC是通过流动相带着样品在固定相/流动相之间反复吸附-解吸附使样品各组分完全分离，有选择性强、专属性好、灵敏度高的特点。分析一个样品，最重要的就是样品的专属性，因此用HPLC测定的准确度要比一般没有经过彻底分离的高。

紫外分光光度法样品前处理是将茶汤经过络合沉淀步骤，然后两次过滤，其操作过程繁琐，工作量较大。由实验结果可知，紫外分光光度法的测定结果大于HPLC法。原因可能是分光光度法测得的咖啡碱包含了与咖啡碱结构类似的嘌呤碱及其它物质，所测结果不够精准，这是分光光度法的局限性，这种局限性在周顺珍的研究结果中也有说明[11]。

此外，GB/T 8312-2013紫外分光光度法中设计的咖啡碱标曲梯度最高浓度为0.012mg/ml，对应吸光度为0.568，如果样品测定依照国标准确吸取10ml试液进行反应、过滤，之后测吸光度，预实验结果显示，大部分样品的吸光度超过标准曲线的最高吸光度，并且部分信阳红样品的吸光度将大于0.8。考虑到紫外分光光度法检测器的工作原理，为保证测量结果的准确性，应控制吸光度在0.2~0.7之间，透光率在20%~65%之间[12]。故本研究中样品测定相比国标有所调整，第一步吸取试液量为国标的一半（5ml），从而使样品吸光度全部在标准曲线范围内。由此可见，采用紫外分光光度法测定茶叶中咖啡碱含量时，若样品吸光度超过标曲的吸光范围，甚至大于0.8，为保证实验科学、严谨，应将试液稀释后再使用，或者第一步反应试液用量减半。

[1] 谭和平，叶善蓉，邹燕等.茶叶中生物碱的分析方法概述[J].中国测试技术，2008(5):5~9.

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[7] 黄欢，赵展恒，王玉娇等.铁观音加工过程中咖啡碱、茶多酚、游离氨基酸含量变化研究[J].福建农业学报，2014,29（3）:282~285.

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S571.1

A

1006-5768（2019）03-110-05

2019-01-16

信阳市科技成果转化计划项目：信阳毛尖茶精细化、智能化生产关键技术研究与应用（150002）。

余艳芳（1989—），女，河南信阳人，硕士研究生，从事茶叶生化分析与检测研究。Email:576400501@qq.com

（责任编辑：蒋文倩）