IL-28B基因多态性在丙型肝炎患者中的分布及临床意义

罗庆元,吕健宏,李高波,蒋 莹*

(1新疆医科大学第二附属医院消化二科,乌鲁木齐 830063;2新疆医科大学第二附属医院感染科;*通讯作者,E-mail:jiangyingabcd@sina.cn)

慢性丙型病毒性肝炎(chronic viral hepatitis C,CHC)是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)引起的一种传染病[1]。由于其高隐匿性、高漏诊率、高慢性化率,近年来我国慢性丙肝新增病例数逐年增多,而且HCV相关并发症问题日益凸显,近20余年来HCV相关肝癌的比例明显升高[1],严重危害着人类健康。

近年来,国内外研究表明宿主遗传基因变异可导致机体免疫功能状态的差异,进而影响丙型肝炎病毒感染的不同临床结局。被国际人类基因组织命名为白细胞介素-28B(IL-28B),是2003年新发现的干扰素家族一员。研究发现,IL-28B基因附近的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与丙型肝炎的发生、发展、治疗转归密切相关[2]。它可用来预测HCV感染者的治疗效果和疾病进展,从而为确定患者个体化治疗方案提供依据[3]。因此,本研究探讨IL-28B基因多态性与CHC临床转归关系。为CHC临床转归、治疗和预后及个体化治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选择2015-01～2018-03在新疆医科大学第二附属医院感染科住院及门诊的126例丙型肝炎患者,男性90例,女性36例,平均年龄(41.83±9.6)岁。汉族65例,维吾尔族61例,所有病例均严格按照中华医学会肝病分会和感染病学分会2015年制定的《慢性丙型肝炎防治指南》进行疾病的规范化诊断,其中15例诊断为肝硬化,其余111例均为CHC患者。所有患者均为居住在新疆地区的常住人口,所有入选对象排除心血管疾病、高血压、糖尿病、肾功不全、其他感染性疾病、免疫性疾病。本次研究经过我院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

1.2 样本采集和处理

采集清晨空腹外周静脉血2 ml EDTA抗凝,-20 ℃保存。

采用全血基因组DNA提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司)提取全基因组DNA,DNA的提取步骤按照试剂盒说明书提取。纯度检测合格,置于-80 ℃冰箱保存备用。在ABI7500型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应。根据IL-28B的rs12979860和rs12980275基因位点,由上海天昊生物科技有限公司设计PCR引物并合成(见表1)。PCR反应体系为25 μl:DNA提取液1 μl,2×Master Supermix Taq酶12.5 μl,上下游引物各1 μl,ddH2O 9.5 μl。反应条件:95 ℃热变性5 min,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃ 45 s,共35个循环,72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。将PCR产物送至上海生工测序公司对产物进行测序,测序结果利用MEGA 4.0软件进行序列比对判定基因型。

表1 PCR测序引物

Table 1 Primers for PCR sequencing

SNP位点 上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′)rs12979860AGGCTCAGGGTCAATCACAGAAGGGAGCTCAAGCTGGAGGTGGGACATGrs12980275CCTGTAACCCCAGCACTTTAACCCTCTTGCCTCAGTCT

1.3 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行分析。计数资料比较进行χ2检验,计量资料进行t检验,非条件Logistic回归模型计算比值比(OR)及其95%可信区间(CI)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床特征

本研究入组的126例丙型肝炎患者,CHC组111例,肝硬化组15例,以男性为主,各组之间性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 126例丙型肝炎患者一般资料

Table 2 General data of 126 patients with hepatitis C

分组 男性[例(%)]年龄(岁)慢性丙型肝炎组79(71.17)41.92±8.56 肝硬化组11(73.33)43.12±10.22

2.2 基因组DNA的提取

2.2.1 提取的DNA组1 μl进行电泳检测结果,凝胶电泳可见清晰的DNA条带,DNA的浓度和纯度的检测结果显示大多样本的rs12979860浓度在300-450 bp之间;rs12980275浓度在300 bp左右(见图1,2)。

M.DAN ladder; 1-7,9-12.rs12979860的目的片段;8.空白对照图1 rs12979860的PCR产物电泳结果Figure 1 Electrophoretic results of PCR products of rs12979860

2.2.2 基因型分布 宿主IL-28B rs12979860位点基因测序结果显示,CC型110例(87.3%),CT型13例(10.3%),TT型3例(2.4%);等位基因分布频率,C为233(92.5%),T为19(7.5%)。

宿主IL-28B rs12980275位点基因测序结果显示,AA型94例(74.6%),AG型32例(25.4%),GG型0例;等位基因分布频率,A为220(87.2%),G为32(12.7%)。在各组中均未检测到GG型。

M.DAN ladder; 1-11.rs12980275的目的片段;12.空白对照图2 rs12980275的PCR产物电泳结果Figure 2 Electrophoresis results of PCR products of rs12980275

2.3 IL-28B基因型频率在汉族和维吾尔族比较

检测结果表明,rs12979860位点存在三种基因型CC/CT/TT,两组位点的频率符合Hardy-Weinbery遗传平衡(P>0.05),表明此位点的频率在汉族与维吾尔族CHC患者中分布均匀。新疆地区汉族、维吾尔族间IL-28B基因rs12979860 TT位点的基因型频率无显著差异(P>0.05),其等位基因频率C/T在两组间分布差异无统计学意义(P=0.804,见表3)。新疆地区汉族、维吾尔族间IL-28B基因rs12980275A/G位点的基因型频率存在显著差异(P=0.026),其等位基因频率C/T在两组间分布差异有统计学意义(P=0.039,见表4)。

表3 IL-28B基因型rs12979860 C/T在汉族、维吾尔族之间的比较

Table 3 Comparison of rs12979860 C/T of IL-28B gene type between Han and Uygur nationalities

分组n基因频率等位基因CCCTTTχ2PCTχ2P汉族6559(90.8)4(6.2) 2(3.0)4.2420.120122(93.8)8(6.2)0.1500.804维吾尔族6152(85.2)9(14.8)0(0.0)113(92.6)9(7.4)

表4 IL-28B基因型rs12980275A/G在汉族、维吾尔族之间的比较结果

Table 4 Comparison of IL-28B genotype rs12980275A/G between Han and Uygur nationalities

分组n基因频率等位基因AAAGχ2PAGχ2P汉族6554(83.1)11(17.0)5.0880.026119(91.5)11(8.5) 4.3480.039维吾尔族6140(65.6)21(34.4)101(82.8)21(17.2)

2.4 肝硬化患者和CHC患者IL-28B rs12979860基因型频率比较结果

IL-28B rs12979860基因型频率TT的比例在肝硬化组和CHC组中的比例分别为13.3%和0,差异有统计学意义(χ2=4.525,P<0.05,见表5,6)。显示CHC的T等位基因型的存在可能与CHC进展为肝硬化有关。

表5 IL-28B基因型rs12979860 C/T在肝炎不同阶段的比较结果

Table 5 Comparison of IL-28B genotype rs12979860 C/T at different stages of hepatitis

分组 n基因型频率 等位基因 CCCT TT χ2P CT χ2P肝硬化组15 12(80.0)1(6.7) 2(13.3) 4.5250.01 25(83.3)5(16.7) 5.3280.038CHC组111 99(89.2)12(10.8) 0(0.0) 210(94.6)12(5.4) OR(95%CI)1.000(REF)1.457(1.024-3.128)1.522(1.012-3.247)1.000(REF)0.286(0.093-0.878)

表6 IL-28B基因型rs12980275A/G在肝炎不同阶段的比较结果

Table 6 Comparison of IL-28B genotype rs12980275A/G at different stages of hepatitis

分组n基因型频率等位基因 AAAG χ2P AG χ2P肝硬化组15 10(66.7)5(33.3) 4.1830.044 25(83.3)5(16.7) 0.4840.557CHC组111 84(75.7)27(24.3) 195(87.8)27(12.2) OR(95%CI)1.000(REF)2.117(0.895-4.253)1.000(REF)0.692(0.224-1.961)

3 讨论

丙型肝炎患者在世界范围内约有2亿人,HCV感染增加了发展为肝硬化和肝癌的风险[4]。除病毒因素外,宿主因素(年龄、性别、种族、宿主基因等)与丙型肝炎的发生发展也密切相关。就目前来说,CHC的抗病毒治疗仍然是困扰着我们的一个难题[5]。随着人类认知水平的提高和相应序列测序及分析方法的进步,基因多态性在各种疾病中的影响逐渐受到重视[6]。HCV病毒感染人体后,促进IL-28B的分泌和合成,IL-28B基因多态性对肝细胞内干扰素刺激基因(interferon stimulated gene,ISG)的表达有调节作用,低病毒载量的丙型肝炎患者,ISG表达上调,限制了应用外源性干扰素进一步刺激ISG上调表达的作用,导致持续病毒学应答(SVR)的概率下降;而高病毒载量的丙型肝炎人群ISG基因表达水平较低,当给与外源性干扰素的时候,可大幅度刺激ISG的表达上调,产生干扰素α,从而达到抗病毒的效果,而内源性干扰素在病毒清除及抗病毒治疗中的作用甚微;主要与其妨碍干扰素传导通路有关[7,8],从而决定干扰素抗HCV疗效及HCV的自发清除。Ⅲ型干扰素由病毒感染诱导产生,目前已经明确Ⅲ型干扰素在体内和体外都具有免疫调节和抗病毒效能,并且可以促进IFN-α的产生[9]。但是对于IL-28B基因多态性是否与HCV感染后病情进展相关尚未得出结论[10],在我们的研究中发现IL-28B基因位点rs12980275与CHC的发生发展相关,rs12980275A/G基因型分布频率在汉族维吾尔族之间存在比较大的差异;这解释了不同民族患者治疗反应差异大的原因,有些感染HCV后会发挥自我清除,提示我们可以通过检测患者的IL-28B基因型来识别并选择最佳治疗方案,更可能从个体化的治疗中受益[11,12]。

此外将126例患者分为CHC组和肝硬化组进行比较,在丙型肝炎疾病发展的进程中,患者体内分布的IL-28B的基因型表达也是不同的,其等位基因TT在肝硬化和CHC组中出现频率是13.3%,0,差异有统计学意义(P<0.01),IL-28B rs12979860 TT等位基因可能跟丙型肝炎病毒在肝细胞内的复制有关,TT等位基因可促进病毒的复制量,使患者更快地进入肝硬化阶段[13]。综上所述,IL-28B基因多态性可能和HCV感染后疾病的预后、转归有密切关系,还与不同民族感染后的治疗效果相关[14]。而国内对宿主IL-28B rs12980275位点相关研究较少,本研究基因测序结果显示,AA型94例(74.6%),AG型32例(25.4%),GG型0例;A等位基因分布频率220(87.2%)G等位基因分布频率32(12.7%)。在各组中均未检测到GG型,提示我院SNPrs12980275位点GG型所占比例较低,SNPrs12980275位点均未检测到GG型,可能与本实验样本数较少有关,有待进一步的大样本检测。结果表明IL-28B基因rs12980275位点基因多态性与肝硬化的发生有显著关系,在汉族、维吾尔族患者之间无差异。虽然IL-28B基因SNP影响病毒清除的机制尚未清楚,但其关联分析结果可作为HCV患者临床治疗的个体化用药的辅助指导[15,16],将有助于预测慢性丙肝的临床转归和指导治疗。