S100A7在结直肠癌组织中表达及对结直肠癌HCT116细胞增殖和侵袭的影响

黄琰菁,王 琳,李 赛,盛 莉,王海霞,杨生辉

(海南省人民医院肿瘤内科,海口 570311;*通讯作者,E-mail:wanglin7209@163.com)

随着我国居民生活方式改变及人口老龄化,结直肠癌发病率及病死率不断升高[1]。该肿瘤发病隐匿,早期缺乏典型症状,多数患者确诊时已处于中晚期。同时,患者术后复发和转移率较高,尽管近年来临床诊疗手段不断提高,但患者总体预后依然不佳[2,3]。因此,深入探讨结直肠癌早期诊断的新的标志物及影响该肿瘤复发和转移的基因靶点,已成为临床研究重点。S100A7作为钙结合蛋白S100蛋白家族成员,在与钙离子结合后可与靶蛋白结合,在调控细胞增殖、分化、凋亡等过程中发挥重要作用[4],同时,亦与细胞间信号传导、脂质调节、免疫炎症反应密切相关[5]。近年来研究发现,该蛋白在多种恶性肿瘤组织中表达异常,可能参与了恶性肿瘤发生、进展过程[6]。本研究分析结直肠癌组织中S100A7蛋白表达,探讨其与患者临床病理特征之间的相关性,并观察其对结直肠癌细胞增殖和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取2013-06-02～2015-06-05在海南省人民医院接受手术切除治疗的结直肠癌患者136例，入选患者临床资料完整且术前未接受放疗、化疗，术后经病理学检查确诊。其中，男性77例，女性59例，年龄35-77岁，平均年龄(59.31±11.42)岁，中位年龄56岁，肿瘤部位：结肠61例，直肠75例；分化程度：低分化45例，中分化61例，高分化30例；参照2009年国际抗癌联盟TNM分期标准[7]：Ⅰ期+Ⅱ期83例，Ⅲ期+Ⅳ期53例；发生淋巴结转移48例。留取结直肠癌组织和肿瘤边缘>5 cm且经病理学检查证实的正常癌旁组织，甲醛固定，石蜡包埋保存。本研究通过海南省人民医院伦理委员会批准(编号：20140318ZL06)，患者均行知情同意。

1.2 细胞株及主要试剂

人结直肠癌HCT116细胞购自中科院上海细胞资源中心。免疫组化试剂盒及配套试剂购自天津市灏洋生物技术有限公司,鼠抗人S100A7单克隆抗体(克隆号52948)购自美国Santa Cruz公司,Lipofectamine 2000转染试剂和Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司,逆转录和PCR扩增试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,S100A7干扰序列和阴性对照序列由上海美轩生物科技有限公司设计合成,S100A7基因序列和β-actin内参由上海生工生物公司设计合成,CCK-8试剂购自美国Sigma公司,Transwell小室购自美国Corning公司,Matrigel基质胶购自美国BD公司,兔抗人E-钙黏蛋白(E-cadherin)单克隆抗体(克隆号3195S)和兔抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(克隆号5741S)购自美国CST公司。

1.3 免疫组化法检测结直肠癌和癌旁组织中S100A7蛋白表达

取石蜡标本，切片、脱蜡、至水，加入过氧化氢(体积分数3%)，放到枸橼酸缓冲液(pH6.0)中行高压抗原修复，冷却，血清封闭，加入一抗，4 ℃过夜孵育，加入二抗，DAB显色，苏木精复染，透明、封片、观察。以PBS替代一抗作为阴性对照。结果判定：S100A7蛋白主要表达于细胞浆和胞核，半定量法判定结果[8]：①染色强度：0分，不染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，黄褐色；②阳性细胞比例：0分，阳性细胞比例≤5%；1分，6%≤阳性细胞比例≤25%；2分，26%≤阳性细胞比例≤75%；3分，阳性细胞比例>75%；③将染色强度评分与阳性细胞比例评分乘积作为总评分，阴性：1-3分，阳性：≥4分。

1.4 病例随访

所有患者于术后第2天开始随访,院外随访形式包括电话和门诊,以死亡作为终点事件,获得总生存期(overall survival,OS),随访截止日期2018年6月30日,随访中失访11例,125例获得随访,随访率91.91%,随访时间1-60个月,中位随访时间26.2个月。

1.5 细胞培养及分组

用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基对HCT116细胞培养，培养条件：饱和湿度、5% CO2、37 ℃。胰酶消化，传代培养。取对数生长细胞，根据转染试剂盒说明对细胞分组转染：①S100A7干扰序列组：转染S100A7小分子干扰RNA(siRNA)序列以沉默S100A7基因表达：5′-CTCACTCATCCTTCTACTCG CGAGTAGAAGGATGAGTGAGA-3′；②阴性对照组：转染阴性对照序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；③空白组：不作任何处理。转染后继续培养48 h完成后续实验。

1.6 实时荧光定量PCR技术检测细胞中S100A7基因表达

取各组转染后培养48 h细胞,加入细胞裂解液,按Trizol总RNA提取试剂盒说明提取总RNA,并检测其纯度。按照逆转录试剂盒操作说明对总RNA逆转录为cDNA,按照PCR试剂盒说明以cDNA为模板对引物进行扩增。引物序列:S100A7上游:5′-TGGTAGTCTGTGGCTATGTCTCCC-3′,下游:GCATGATCGACATGTTTCACAAATA-3′;β-actin上游:5′-ATGGTGGGAATGGGTCAGAAG-3′,下游:5′-TCCATGTCGTCCCAGTTGGTA-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，74 ℃扩增30 s，36个循环。每个样品设6个平行复孔。用2-ΔΔCt法计算各组细胞中S100A7 mRNA相对表达量。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖

取各组细胞,胰酶消化,接种于96孔板,细胞密度为2×104/孔,恒温培养。分别于培养12,24,48,72,96 h时,各孔加入10 μl的CCK-8液,恒温培养120 min,使用酶标仪取450 nm波长处检测各孔吸光度OD值,反映各组细胞增殖能力。

1.8 Transwell法检测细胞侵袭能力

按照1 ∶6的比例用无血清培养液对Matrigel基质胶稀释,平铺于Transwell小室上室,风干以备用。取各组转染后培养48 h细胞,消化,用无血清培养液重悬,细胞密度5×105/ml,取200 μl加入小室上室,将含20%胎牛血清的培养液600 μl加入下室,恒温培养24 h,使用40 g/L多聚甲醛固定10 min,0.1%结晶紫染色15 min,将内膜表面散落细胞轻轻去除,镜下随机取10个视野计数穿膜细胞数,以表示细胞侵袭能力。

1.9 蛋白质印迹检测细胞中S100A7、E-cadherin和Vimentin蛋白表达

取各组转染后培养48 h细胞,加入细胞裂解液,冰上裂解1 h,4 ℃下12 000 r/min离心5 min,离心半径8 cm,提取总蛋白,并利用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。取50 μg总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电转移至聚偏氟乙烯膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,分别将一抗兔抗人S100A7抗体、兔抗人E-cadherin和波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体(稀释比例1 ∶800、1 ∶500和1 ∶1 200)加入,4 ℃过夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入化学发光试剂，避光反应15 min，拍照，利用Image J图像分析软件分析，以目的蛋白条带的光密度值与内参GAPDH条带的光密度值的比值作为该目的蛋白的相对表达量

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 结直肠癌和癌旁组织中S100A7蛋白表达

S100A7蛋白在结直肠癌组织中阳性表达率为77.9%(106/136),高于癌旁组织中的33.1%(45/136),差异有统计学意义(χ2=55.394,P<0.001,见图1)。

A.癌旁组织 B.结直肠癌组织图1 免疫组化法检测结直肠癌和癌旁组织中S100A7蛋白表达 (×200)Figure 1 The expression of S100A7 protein in colorectal cancer and adjacent tissues by immunohistochemistry (×200)

2.2 结直肠癌组织中S100A7蛋白表达与临床指标间相关性

结直肠癌组织中S100A7蛋白表达与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05),而与TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05,见表1)。

表1 结直肠癌组织中S100A7蛋白表达与临床指标间的关系例(%)

Table 1 Correlation between the expression of S100A7 protein and clinical indicators in colorectal cancercases(%)

指标nS100A7蛋白阳性阴性χ2P年龄(岁)0.0170.897 ≥609272(78.3)20(21.7) <604434(77.3)10(22.7)性别0.1690.681 男性7761(79.2)16(20.8) 女性5945(76.3)14(23.7)肿瘤部位3.5700.059 结肠6143(70.5)18(29.5) 直肠7563(84.0)12(16.0)肿瘤大小0.2140.643 <5 cm6451(79.7)13(20.3) ≥5 cm7255(76.4)17(23.6)分化程度0.2230.637 低分化4534(75.6)11(24.4) 中高分化9172(79.1)19(20.9)TNM分期8.0510.005 Ⅰ+Ⅱ期8358(69.9)25(30.1) Ⅲ+Ⅳ期5348(90.6)5(9.4)淋巴结转移5.8480.016 是4843(89.6) 5(10.4) 否8863(71.6)25(18.4)

2.3 S100A7蛋白表达对结直肠癌患者生存时间的影响

Kaplan-Meier生存分析结果显示,S100A7蛋白阳性表达组患者平均生存时间31.4个月,累积生存率35.4%,S100A7蛋白阴性表达组患者平均生存时间48.6个月,累积生存率69.2%,Log-Rank检验差异有统计学意义(χ2=9.935,P=0.002,见图2)。

2.4 患者预后影响因素的回归分析

Cox比例风险回归模型结果显示,TNM分期、淋巴结转移和S100A7蛋白表达是影响患者预后的风险因素(HR=2.181,2.121和2.228,均P<0.05,见表2)。

图2 Kaplan-Meier法分析S100A7蛋白表达对结直肠癌患者生存时间的影响Figure 2 Kaplan-Meier analysis for the effect of S100A7 protein expression on survival time of patients with colorectal cancer

表2 患者预后影响因素的Cox比例风险回归模型分析

Table 2 Cox proportional hazard regression model analysis for the affecting factors of patient prognosis

因素 偏回归系数(B)偏回归系数的标准误(SE)统计量(Wald)P相对危险度及95%可信区间[OR(95%CI)]年龄-0.1150.2610.1930.6600.892(0.535-1.487)性别0.0380.2600.0220.8831.039(0.624-1.731)肿瘤部位0.0860.2570.1120.7381.090(0.659-1.802)肿瘤大小0.1600.2690.3560.5511.174(0.693-1.989)分化程度-0.0410.2590.0250.8740.960(0.578-1.595)TNM分期0.7800.2569.3080.0022.181(1.322-3.599)淋巴结转移0.7520.2479.2530.0022.121(1.307-3.443)S100A7蛋白表达0.8010.3984.0600.0442.228(1.022-4.857)

2.5 细胞中S100A7基因表达比较

S100A7干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞中S100A7 mRNA相对表达量分别为0.39±0.05,1.04±0.05和1.00±0.02,三组间比较差异有统计学意义(F=472.982,P=0.000),阴性对照组和空白组细胞中S100A7 mRNA相对表达量差异无统计学意义(P=0.163),S100A7干扰序列组细胞中S100A7 mRNA相对表达量低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000)。

2.6 细胞增殖能力比较

三组细胞24,48,72,96 h时OD值比较差异有统计学意义(均P<0.05),阴性对照组和空白组24,48,72,96 h时OD值差异无统计学意义(均P<0.05),S100A7干扰序列组24,48,72,96 h时OD值低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(均P<0.05,见表3)。

组别 12 h24 h 48 h 72 h 96 h 空白组0.12±0.040.40±0.060.54±0.040.71±0.080.82±0.09阴性对照组0.15±0.050.42±0.100.52±0.090.68±0.100.79±0.11S100A7干扰序列组0.17±0.050.28±0.05∗#0.37±0.03∗#0.48±0.06∗#0.58±0.06∗# F1.8196.903 15.114 13.814 24.836 P0.1960.007<0.001<0.001<0.001

与空白组比较,*P<0.05;与阴性对照组比较,#P<0.05

2.7 细胞迁移和侵袭能力比较

S100A7干扰序列组、阴性对照组和空白组侵袭细胞数分别为(81.26±4.46)个、(118.74±7.21)个和(122.15±6.09)个,三组间差异有统计学意义(F=85.070,P<0.001);阴性对照组和空白组侵袭细胞数比较差异无统计学意义(P=0.343);S100A7干扰序列组侵袭细胞数均低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

A.S100A7干扰序列组 B.阴性对照组 C.空白组图3 Transwell法检测3组细胞侵袭能力 (结晶紫,×200)Figure 3 Invasive ability of cells in three groups by Transwell method (Crystal violet×200)

2.8 细胞中S100A7、E-cadherin和Vimentin蛋白表达

S100A7干扰序列组、阴性对照组和空白组细胞中S100A7、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(均P<0.05)。阴性对照组和空白组细胞中S100A7、E-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量比较无差异(P=0.129,0.644,0.088);S100A7干扰序列组细胞中S100A7和Vimentin蛋白相对表达量均低于阴性对照组和空白组(均P<0.05),而E-cadherin蛋白相对表达量高于低于阴性对照组和空白组,差异有统计学意义(P=0.000和0.000,见表4和图4)。

组别 S100A7蛋白 E-cadherin蛋白 Vimentin蛋白 空白组0.86±0.070.30±0.080.82±0.04阴性对照组0.80±0.060.32±0.060.77±0.07S100A7干扰序列组0.27±0.05∗#0.72±0.04∗#0.38±0.04∗# F226.241 92.265 138.088 P<0.001<0.001<0.001

与空白组比较,*P<0.05;与阴性对照组比较,#P<0.05

图4 蛋白质印迹检测细胞中S100A7、E-cadherin和Vimentin蛋白表达Figure 4 Expression of S100A7, E-cadherin and Vimentin proteins in cells by Western blotting

3 讨论

结直肠癌作为消化系统高发恶性肿瘤,发病率仅次于胃癌和食管癌,且出现年轻化趋势[9]。该病病因复杂,其发生、进展及复发和转移相关机制尚未完全清楚,使其早期防治成为困难[10]。S100A7作为一种新近发现的S100蛋白家族成员,基因位于人染色体1q21,在与钙离子结合后,通过构象变化而使靶蛋白结合位点暴露,在与特定的蛋白结合后可在多种生理、病理过程中发挥重要作用[11],参与了细胞增殖、分化、凋亡、迁移、黏附、信号转导等过程[12],且与肿瘤发生及恶性化过程密切相关[13]。本研究结果显示,结直肠癌组织中S100A7蛋白阳性表达率高于癌旁组织,说明S100A7蛋白在结直肠癌组织中呈高表达,可能参与了结直肠癌发生过程。本研究结果显示,TNM分期Ⅲ+Ⅳ期和发生淋巴结转移的结直肠癌组织中S100A7蛋白阳性表达率增加,说明S100A7蛋白可能参与了结直肠癌恶性化过程。

小分子RNA干扰(small RNA interfere,siRNA)技术作为肿瘤实验研究的常用方法,通过特异性对目标基因进行沉默以阻断基因活性,用以观察该基因与肿瘤细胞生物学活性间的相关性[14]。本研究利用siRNA技术特异性沉默结直肠癌细胞中S100A7基因,实时荧光定量PCR和Western blot实验结果均显示,S100A7干扰序列组细胞中S100A7 mRNA和蛋白相对表达量均低于阴性对照组和空白组,提示S100A7干扰序列组中结直肠癌细胞中S100A7基因表达被成功抑制。有研究指出[15],S100A7基因参与了肿瘤细胞增殖。本研究结果显示,S100A7干扰序列组24,48,72,96 h时OD值低于阴性对照组和空白组,说明特异性沉默结直肠癌细胞中S100A7基因表达可有效抑制细胞增殖能力,提示S100A7基因参与了结直肠癌细胞增殖过程。有研究指出,S100A7可通过调控细胞间黏附而在肿瘤细胞迁移和侵袭中发挥重要作用[16]。本研究结果显示,S100A7干扰序列组侵袭细胞数均低于阴性对照组和空白组,特异性沉默结直肠癌细胞中S100A7基因表达可抑制结直肠癌细胞侵袭力,提示S100A7基因参与了结直肠癌细胞侵袭过程。有研究指出[17],S100A7促进了子宫内膜癌细胞侵袭转移和上皮-间质转化。而上皮-间质转化是肿瘤细胞增殖和侵袭转移的重要机制[18],发生上皮-间质转化时,上皮细胞的形态及表型向间充质细胞改变,其中,上皮性标志物(如E-cadherin)表达降低,而间充质细胞标志物(Vimentin)表达升高[19],本研究结果显示,S100A7干扰序列组细胞中Vimentin蛋白相对表达量均低于阴性对照组和空白组,而E-cadherin蛋白相对表达量升高,说明特异性沉默结直肠癌细胞中S100A7基因表达可有效抑制上皮-间质转化,提示S100A7可能通过调控结直肠癌上皮-间质化过程而参与了细胞增殖及侵袭过程。

综上所述,S100A7蛋白在结直肠癌组织中呈高表达,且与肿瘤恶性化过程有关,特异性沉默结直肠癌细胞中S100A7基因表达可抑制细胞增殖、迁移及侵袭,其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关,有望为结直肠癌机制研究及基因治疗提供新的靶位。