Ghrelin蛋白预处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

黄 康,周艺蕾,陆士娟,钟江华,张 伟,李 强

(中南大学湘雅医学院附属海口医院心血管内科,海口 570208;*通讯作者,E-mail:1157416676@qq.com)

心血管疾病严重威胁人类健康,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是冠心病的急重症,发病率呈上升趋势。研究显示,急性心肌梗死的患者进行溶栓或介入治疗后,在30 d的随访期内,仍有5%-6%心血管事件的发生,经相关检测证实,其中最高可达50%的心肌梗死面积是由“缺血/再灌注损伤”引起的[1]。可见心肌缺血/再灌注损伤是影响急性心肌梗死患者预后的重要因素,因此探讨如何尽早恢复缺血心肌组织血液灌流而又不发生再灌注损伤的方法是临床急需解决的问题。

缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)是减轻缺血/再灌注损伤发生时心肌内源性的保护机制。研究表明,位于线粒体上的ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)开放时,引起K+内流,线粒体胞内基质容积增加,激活线粒体呼吸反应链,增加ATP的合成,改变线粒体的能量状态,参与了IPC过程中对心肌的保护作用[2]。Ghrelin是一种自大鼠胃黏膜中分离出来的小分子多肽,具有促进生长激素释放和调节胰岛素抵抗和抗炎的作用[3,4]。研究发现Ghrelin可以抑制动脉粥样硬化的进展[5],改善心肌梗死后心肌重构,减少恶性心律失常的发生,从而减轻缺血/再灌注损伤[6-9],对心血管系统具有明确的保护作用。而线粒体KATP通道既是心肌保护的效应器,也在心肌缺血/再灌注损伤中起着重要作用,Ghrelin是否通过影响线粒体KATP通道的活性来发挥心肌缺血/再灌注损伤的保护作用目前尚缺乏相关研究。

本研究以大鼠心肌缺血/再灌注模型,并给予外源性Ghrelin处理,探讨其是否通过影响ATP的合成,进而导致线粒体KATP通道的开放发挥其保护心肌的作用,以丰富Ghrelin保护心肌的作用机制,为其在临床中的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

Ghrelin蛋白和5-羟基癸酸盐(5-hydroxydecanoic acid sodium salt,5-HD)购买自美国Sigma公司。大鼠肌酸激酶(creatine kinase,CK)检测试剂盒、大鼠肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB)检测试剂盒均购买自瑞士Roche公司,大鼠心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I,cTnI)检测试剂盒购买自美国Abbott公司,丙二醛(malonidialdehyde, MDA)测定试剂盒和总蛋白定量测定试剂盒均购买南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物及分组

8-12周SD大鼠购买自上海斯莱克实验动物科技服务部(许可证号:SCXK(沪)2012-0002),饲养于清洁级动物房内,正常饲养。体质量(250±20)g,随机分为假手术组(sham组,n=10)、I/R模型对照组(n=10)、心肌缺血再灌注+Ghrelin组(I/R+Ghrelin组,n=10)、心肌缺血再灌注+Ghrelin+5-HD组(I/R+Ghrelin+5-HD,n=10)。在手术前10 min给予I/R+Ghrelin组大鼠Ghrelin 100 μg/kg静脉注射，给予I/R+Ghrelin+5-HD组Ghrelin 100 μg/kg及5-HD 5 mg/kg注射。I/R模型对照组及假手术组手术前10 min注射相同剂量的生理盐水。I/R模型制作：大鼠麻醉后，对大鼠进行心电监测，并结扎大鼠心脏冠状动脉的前降支，30 min后松解结扎线恢复冠状动脉前降支血供，进行30 min再灌注。假手术组大鼠不进行血管结扎,其余手术操作相同。

1.3 大鼠缺血再灌注模型的制备

通过结扎大鼠冠状动脉的左冠状动脉前降支,心电图ST段呈弓背向上抬高提示缺血模型制备成功,结扎左冠状动脉前降支30 min,松解结扎线,此时心电监测显示Ⅱ导联ST段下降1/2,且缺血表现的心肌组织颜色逐渐变红,提示心肌组织恢复血液灌注。假手术组采用同样术式,但不结扎左冠状动脉。

1.4 采用ELISA法进行CK、CK-MB、cTnI检测

再灌注结束后分别收集各组大鼠静脉血,使用生化试剂盒进行检测,按照说明书进行样品准备,罗氏Cobas C501型全自动生化分析仪检测血浆中CK、CK-MB和cTnI的含量(以上操作在海口市人民医院检验科完成)。

1.5 采用比色法进行心肌组织中MDA含量测定

取出大鼠心脏，预冷生理盐水充分洗净血液后，使用滤纸吸干水份，迅速测量重量，选择目标部位心室肌，按照1 ∶9的质量体积比加入匀浆液在低温状态下进行匀浆，充分匀浆后1 000 r/min在4 ℃环境下离心15 min，取上清-20 ℃保存备检,按照MDA检测试剂盒步骤进行心肌组织MDA含量测定。

1.6 采用比色法进行心肌组织中ATP含量测定

造模结束后，迅速剪下心脏，在目标部位剪取全层心肌组织，迅速称重，按照每20 mg心肌组织中加入100-200 μl裂解液比例加入裂解液，然后置于提前预冷的玻璃匀浆器中进行充分匀浆。之后置于冰上裂解10 min，在4 ℃ 12 000g进行离心5 min，收集上清用于后续检测。然后按照ATP检测试剂盒要求制作心肌组织匀浆提取心肌组织中的ATP，并进行ATP含量的测定。

1.7 透射电镜观察线粒体超微结构的变化

腹腔注射1.8%戊巴比妥钠麻醉大鼠,取心脏组织,修剪成1 mm×1 mm×1 mm长条形,置于2.5%戊二醛固定。固定后经过脱水,浸透,包埋,聚合等处理后,定位制成超薄切片,厚度约120 nm,在透射电镜下观察。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 不同处理组大鼠外周血中CK、CK-MB、cTnI的含量和大鼠心肌组织中MDA和ATP的含量比较

与sham组相比,I/R组和I/R+Ghrelin+5-HD组外周血肿CK、CK-MB、cTnI及MDA含量均明显升高,ATP含量迅速下降(P<0.05)。与I/R组相比较,I/R+Ghrelin组外周血中CK、CK-MB、cTnI及MDA的含量明显下降,ATP含量迅速升高(P<0.05);与sham组比较,I/R+Ghrelin组外周血中除了CK,CK-MB、cTnI的含量升高,而大鼠心肌组织中MDA和ATP的含量均不同程度降低,差异无统计学意义(P>0.05)。与I/R组比较,I/R+Ghrelin+5-HD组大鼠外周血中CK、CK-MB、cTnI的含量和大鼠心肌组织中MDA和ATP的含量相近(P>0.05);与I/R+Ghrelin组相比,I/R+Ghrelin+5-HD组CK、CK-MB、cTnI及MDA含量升高,ATP含量迅速下降(P<0.05,见表1,2)。

表1 不同处理组大鼠外周血中CK、CK-MB及cTnI的含量

Table 1 The expression of CK, CK-MB and cTnI in peripheral blood of rats in different treatment groups

组别 CK(U/L) CK-MB(U/L)cTnI(ng/ml)假手术组 608.75±194.44 452.60±71.320.11±0.05I/R模型对照组6661.75±1938.13∗∗1082.75±218.02∗∗1.66±0.24∗∗I/R+Ghrelin组3805.25±336.79# 680.67±188.02#0.24±0.08##I/R+Ghrelin+5-HD组6804.00±2048.58Δ 855.80±247.85Δ1.86±0.61ΔΔ

与假手术组比较,**P<0.01;与I/R模型对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;与I/R+Ghrelin组相比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01

表2 不同处理组大鼠心肌组织中MDA和ATP的含量

Table 2 The expression of MDA and ATP in rat cardiac tissue in different treatment groups

组别 MDA(nmol/mg)ATP(μmol/g)假手术组1.86±0.32238.59±77.25I/R模型对照组2.37±0.23∗56.68±17.17∗∗I/R+Ghrelin组1.74±0.18##107.67±32.02#I/R+Ghrelin+5-HD组2.62±0.68Δ68.74±32.03Δ

与假手术组比较,*P<0.05,**P<0.01;与I/R模型对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;与I/R+Ghrelin组比较,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01

2.2 不同处理组大鼠线粒体结构情况

在sham组中线粒体结构正常,典型的双层膜结构完整,线粒体嵴及其内膜上附着的基粒结构完整、排列有序,无空泡产生,亦无明显嵴断裂情况(见图1A)。在I/R组中,可见心肌细胞线粒体中存在大量空泡,线粒体明显肿胀,内部可见部分致密颗粒状物质沉积,双层膜结构显示不清,线粒体嵴明显断裂、缺失(见图1B)。在I/R+Ghrelin组,与I/R组相比较,线粒体的结构尚完整,病变明显减轻,虽可见部分线粒体空泡样变,但膜结构尚清晰、完成,线粒体嵴断裂及缺失情况较少,线粒体嵴较为光滑(见图1C)。在I/R+Ghrelin+5-HD组,线粒体损伤较较Ghrelin蛋白处理组严重,但较I/R线粒体病变仍较轻,出现空泡样变和线粒体嵴断裂、缺失的情况较少,线粒体双层膜结构尚存在(见图1D)。以上提示,Ghrelin蛋白可以在缺血/再灌注损伤过程中,通过保护线粒体结构和功能的完整性对心肌细胞发挥保护作用,减轻继发的严重缺血/再灌注损伤。而在线粒体KATP通道被阻断后,这种保护作用削弱,线粒体的结构仍受到部分破坏,提示Ghrelin蛋白可以通过线粒体KATP通道发挥保护作用,但这种保护作用并不是完全由线粒体KATP通道介导的。

图1 电镜下观察各组大鼠心肌细胞线粒体结构Figure 1 Mitochondrial structure of myocardial cells of rats in four groups under electron microscope

3 讨论

急性心肌梗死早期给予溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗是有效恢复心肌灌注、缩小梗死面积,挽救患者生命、降低不良预后的有效方法,但心肌缺血/再灌注损伤是目前面临的主要问题。缺血/再灌注损伤的机制主要包括氧自由基损伤、Ca2+超载、心肌能量代谢障碍及内皮细胞损伤等[10],线粒体功能障碍在心肌缺血/再灌注损伤中占有重要地位[11]。研究显示线粒体KATP是线粒体心肌保护的重要作用靶点。线粒体KATP发挥心肌保护的作用机制主要包括以下几个方面:抑制线粒体内Ca2+超载[12,13],维持能量代谢平衡以及线粒体数量[14],抑制氧自由基的产生,缩小心肌梗死面积[15]及抑制心肌细胞凋亡[16]等。

Ghrelin是一种新型脑肠肽,对心血管系统有着重要的保护作用,动物研究表明,外源性Ghrelin的应用可以显著缩小离体大鼠心脏的梗死面积,减少LDH和肌红蛋白的漏出,增加冠状动脉的血流量、减轻心脏前后负荷、减少缺血/再灌注后心肌细胞的凋亡[17]。本研究在进行缺血/再灌注处理前给予Ghrelin蛋白处理,与I/R组相比较,外周血中CK、CK-MB及cTnI的含量明显下降,而与sham组比较,CK、CK-MB及cTnI的含量变化不明显,说明Ghrelin蛋白可以通过缺血前预处理发挥对心肌细胞的保护作用。国内学者陈莹莹等[18]在研究Ghrelin预处理对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响时发现Ghrelin具有减轻缺氧/复氧所引起的心肌细胞损伤、抑制心肌细胞凋亡的作用。这些研究结果均在一定程度上支持了Ghrelin对心血管系统有着重要保护作用这个结论。同时课题组在冠状动脉前降支血管结扎前给予Ghrelin蛋白预处理,也给予线粒体KATP通道阻断剂5-羟基癸酸盐(5-HD)静脉用药后发现,与I/R组水平接近,而I/R+Ghrelin+5-HD组与I/R+Ghrelin组相比,CK、CK-MB及cTnI含量升高,这一结果提示Ghrelin的保护作用被减弱。由此可见在大鼠中,阻断KATP通道的开放,可以部分抵消Ghrelin对心肌的保护作用,这也说明Ghrelin蛋白可能通过诱导线粒体KATP通道开放而发挥对心肌的保护作用。Oya等[19]发现改变细胞外葡萄糖浓度可以导致分泌Ghrelin的小鼠ghrelinoma 3-1(MGN3-1)细胞内Ca2+浓度增加,并认为KATP和电压依赖性Ca2+通道参与MGN3-1细胞中葡萄糖依赖性生长素释放肽分泌。

在研究Ghrelin蛋白降低大鼠心肌缺血/再灌注引起的氧化应激损伤,并增加ATP生成的机制时,本研究发现I/R组MDA的含量显著上升,而ATP的含量则明显下降,提示心肌组织发生缺血/再灌注损伤后,氧自由基产生增多,而能量产生减少。在给予Ghrelin预处理的I/R+Ghrelin组中,MDA的含量与sham组相比无明显差异,但与I/R组相比较,MDA含量显著下降,提示在缺血/再灌注发生前给予Ghrelin预处理,可以显著减轻再灌注引起的氧自由基损伤。同样,我们实验结果也提示在I/R+Ghrelin组大鼠心肌组织中,ATP的含量虽较sham组有所降低,但两者差异不显著,与I/R组大鼠比较,ATP含量明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明Ghrelin蛋白可以改善再灌注引起的能量生成异常。在I/R+Ghrelin+5-HD组心肌组织中MDA的含量显著上升,明显高于sham组,与I/R组相比较无明显差异。同样ATP的含量也明显下降,显著低于sham组,而与I/R组无明显差异,提示5-HD削弱了Ghrelin蛋白预处理对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用,Ghrelin蛋白对心肌的保护作用可能是通过作用于线粒体KATP通道而发挥的。这和部分学者观点相似,Altunkaynak等[20]在研究线粒体ATP敏感性钾(mitoKATP)通道是否对大鼠硫喷妥钠(TP)或氯胺酮(K)麻醉的心血管作用时发现5-HD阻断mitoKATP通道分别增加了MABP并降低了TP+5-HD和K/X+5-HD组中的HR,并认为mitoKATP通道在影响大鼠K/X和TP麻醉的心血管效应中起着不同的作用。当这些麻醉剂用于与mitoKATP通道相关的实验研究时,应考虑这些麻醉药的血流动力学参数和心律失常评分的差异。

综上所述,本研究提示外源性的Ghrelin可以减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,而这种保护是通过部分逆转心肌线粒体超微结构的破坏,改善线粒体能量生成,减轻氧化应激损伤实现的。进一步研究显示当阻断了线粒体KATP通道之后,Ghrelin蛋白预处理的保护作用受到部分抑制,说明Ghrelin蛋白是通过诱导线粒体KATP通道开放而发挥保护心肌的功能的。Ghrelin蛋白可以通过诱导线粒体KATP通道开放,减少心肌细胞中氧自由基生成,稳定线粒体超微结构,维持心肌细胞能量代谢,从而起到减轻缺血再灌注损伤,保护心肌的作用。本研究丰富了Ghrelin对心肌保护作用的机制研究,为临床上心肌缺血再灌注损伤的防护提供新的治疗靶点。