透明质酸壳聚糖复合凝聚体的流变性能研究

赵伟杰，刘靖康，郭旭虹,2，徐益升,2*

(1华东理工大学化工学院，上海200237；2石河子大学材料化工工程技术中心，新疆 石河子 832003)

复合凝聚体是带相反电荷的聚电解质通过静电作用力自组装形成的液-液相分离产物，通常这些聚电解质包括蛋白质、树枝状大分子、胶束、无机纳米粒子、核苷酸和其他聚电解质等。复合凝聚体的本质是富含聚电解质的致密相与“聚电解质不足”稀释相平衡的产物。如果聚电解质的线性电荷密度足够高并且聚合物链上的电荷是固定的(猝灭，不可电离)，通常会形成絮凝物或沉淀物而不是凝聚体，而只有当聚电解质大分子间静电相互作用的焓与离子损失的熵适当时，才会共同驱动复合凝聚体的形成。相对于絮凝物或沉淀物来说，凝聚体拥有以下优点：(1)宏观均匀和结合紧密的凝聚体处于流动状态更易于处理；(2)具有更低的界面张力。凝聚体可应用于蛋白质纯化[1]和酶固定化[2]。聚电解质大分子形成凝聚体的过程受盐浓度、pH、温度、聚合物浓度及聚电解质自身性质(包括分子量和电荷密度、链柔性)的影响。

在很多带电的聚合物系统中观察到复合凝聚体，例如弹性蛋白多肽类[3]、肝素与聚阳离子[4]、壳聚糖与聚阴离子[5]、贻贝粘性蛋白与透明质酸[6]等，其中壳聚糖(Chitosan,CH)和透明质酸(Hyaluronic acid,HA)由于其独特的性质，如良好的生物相容性和生物可降解性，而在生物材料领域有着广泛的应用[7]。许多研究小组已经对HA/CH复合物进行了研究，例如，HA/CH纳米颗粒可用于哮喘患者的药物输送[8]和基因转染[9]，HA/CH水凝胶可用于伤口愈合[10]，HA/CH薄膜用于细胞增殖的[11]。值得注意的是，尽管对静电相互作用的研究有很多[12-14]，但是对于HA/CH静电相互作用的研究很少，仍然未了解盐浓度和pH等环境因素是如何影响凝聚体形成的，此外，没有明确的方法可用于分析这些影响。

基于对复合凝聚体流变性能的测试可以直观体现聚合物的结合强度，从而研究复合凝聚体的静电相互作用，再结合转换系数在统一架构下分析凝聚体对于环境因素的敏感性，本文以广泛使用的HA/CH复合凝聚体为模型，通过改变pH的方法来调控聚合物上的有效电荷密度以及改变盐浓度来调控2种聚合物之间的静电作用大小，通过流变仪测量HA/CH复合凝聚体(质量比为1∶1)在不同pH和盐浓度下的流变行为，再通过引入转换系数f叠加在不同pH和盐浓度下的流变学曲线得到HA/CH复合凝聚体在不同时间尺度下的流变行为，以此来分析复合凝聚体对于pH和盐浓度的敏感性。

1 实验材料和方法

1.1 试剂与仪器

去离子水，实验室自制；氯化钠，上海凌峰化学试剂有限公司；壳聚糖(Mw=50～190 kDa)，sigma；透明质酸(Mw=93 kDa)，华熙福瑞达生物医药有限公司；盐酸，氢氧化钠等分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

CTK48离心机，湖南湘仪集团；DF-101S恒温加热集热式磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司；Delta320pH计，梅特勒；MCR501流变仪，Anton-Paar Physical。

1.2 HA/CH复合凝聚体的制备

保持pH为4.0，2种聚合物的浓度均为0.5 mg/mL，分别配制不同盐浓度(300、400、500、600 mmol/L)的壳聚糖和透明质酸溶液各225 mL。

保持盐浓度为400 mm，2种聚合物浓度均为0.5 mg/mL，分别配制不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)的壳聚糖和透明质酸溶液各225 mL。

在相同pH或盐浓度情况下将壳聚糖和透明质酸溶液等体积混合，搅拌10 min，所得样品静置至少两天，然后使用离心机在8000 r/min转速下离心样品20 min，去上清液，取下层聚集相即为所需壳聚糖和透明质酸复合凝聚体。

流变测量在Anton-Paar MCR501流变仪上进行，使用半径为25 mm的平行板。测量过程中温度控制在25 ℃，应变0.1%，频率范围0.1～100 Hz。在平板周围滴加制备相应样品时的上清液，以确保测试时样品的湿润[15]。

2 实验结果与讨论

2.1 盐浓度对HA/CH复合凝聚体流变性能的影响

结果见图1。

图1 不同盐浓度(pH 4.0，聚合物浓度 0.5 mg/mL)的HA/CH复合凝聚体的储存/损失模量与频率的关系(a)和HA/CH复合物的损耗角与频率的关系(b)Fig.1 Storage/loss modulus vs.frequency of HA/CH complex coacervates (a),Damping factors vs.frequency of HA/CH complex coacervates (b) with different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL)

G′为储能模量，是测试样品储存能量的量度，而G″为损耗模量，反映了剪切过程中耗散的能量。在固定频率下，损耗模量G小于储能模量G′，复合凝聚体表现得比粘弹性流体更像粘弹性固体。损耗角反映流体消耗能量的特征，其中损耗角正切值tanδ=G″/G′。

图1a表明：HA/CH复合物凝聚体的G′和G″都随着盐浓度的不断增加呈下降的趋势，并且在不同盐浓度下制备的凝聚体具有相似的流变曲线。损耗角正切值与频率的关系(图1b)显示：随着盐浓度的变化，整个损耗角δ呈现出非线性变化的趋势，在盐浓度I(M)=400 mmol/L时达到极大值。前面的工作已经提到HA/CH复合凝聚体在盐浓度400 mmol/L情况下浊度达到最大值，此时两者的结合最多[16]，耗散能量越多。

不同盐浓度下复合凝聚体的复粘度与频率的关系(图2)显示:

所有曲线均显示复粘度随频率呈线性变化。

在同一频率下，粘度随着盐浓度的升高而降低。这是因为盐解离的阳离子和阴离子会作为聚合物链的电荷补充，降低HA/CH复合凝聚体的结合强度。此外，从复合凝聚体的体积也可以看出，盐的存在也增加了吸收到复合物中的水量[17]，聚合物链的松弛更为容易[18]。

在同一盐浓度下，在静止或者低剪切频率时，聚合物链之间相互缠结，复粘度较大，而随着剪切频率不断增加，较为散乱的链状粒子滚动旋转收缩成团，聚合物链发生定向，伸展和缠绕的逐步解体，静电结合的速度小于被破坏的速度，复粘度降低，整个体系显示出剪切变稀的性质[19]。

图2 不同盐浓度(pH 4.0，聚合物浓度 0.5 mg/mL)的HA/CH复合凝聚体的粘度与频率的关系Fig.2 Complex viscosity vs.frequency of HA/CH complex coacervates with different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL)

2.2 pH对HA/CH复合凝聚体流变性能的影响

在盐浓度I(M)=400 mmol/L时，结果(图3a)表明：随着pH的不断增加，HA/CH复合物凝聚体的G′、G″呈上升的趋势。在固定频率下，损耗模量G小于储能模量G′，表明复合凝聚体表现得比粘弹性流体更像粘弹性固体。

图3b显示：随着pH的变化，整个损耗角δ呈现线性变化的趋势，pH越大，损耗角越小；当pH从3.5升至5.5，HA的解离度越来越大，在5.5时完全解离，但CH的解离度基本不变，HA/CH结合越多，耗散能量越多，整个复合凝聚体流变曲线G′的增大幅度大于G″的增大幅度，更趋近于粘弹性固体。

不同pH下复合凝聚体的复粘度与频率的关系(图4)表明：复粘度随频率几乎呈线性变化；在相同频率下，随着pH升高，粘度也上升。这是由于pH对于聚合物链的解离度的影响。当pH在3.5～5.5范围内逐步升高时，HA的解离度也逐步上升。这是因其带电基团显著增多，而CH的解离度基本不变[16]，整个体系复合凝聚体的静电相互作用逐步增强，结合最紧密。随着剪切频率的增强，整个体系呈现出剪切变稀的状态。

图3 不同pH下(I(M) 400 mmol/L，聚合物浓度 0.5 mg/mL)HA/CH复合凝聚体的储存/损失模量与频率的关系(a)和HA/CH复合物的损耗角与频率的关系(b)Fig.3 Storage/loss modulus vs.frequency of HA/CH complex coacervates (a),Damping factors vs.frequency of HA/CH complex coacervates(b) with different pH (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL)

图4 不同pH(I(M) 400 mmol/L，聚合物浓度 0.5 mg/mL)的HA/CH复合凝聚体的粘度与频率的关系Fig.4 Complex viscosity vs.frequency of HA/CH complex coacervates with different pH (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL)

2.3 HA/CH复合凝聚体归一化处理

通过盐浓度转换系数fG,I(M)和pH转换系数fG,pH研究HA/CH复合凝聚体对pH和盐浓度影响的敏感性。研究[16]表明，pH为4.0时，HA/CH复合物浊度在盐浓度400 mmol/L时达到最大值，再结合图1b可知：在此条件下，HA/CH复合凝聚体的粘度最大，结合最多，因此在pH=4.0时，设定盐浓度400 mmol/L的转换系数为1，其中盐浓度转换系数为：式(2)中：G是模量，N是数据个数。

fG,I(M)=

(1)

上式中：G是模量，N是数据个数，I(M)是盐浓度。

研究[16]表明，盐浓度400 mmol/L时，HA/CH复合物浊度在pH>5.0时达到最大值，结合图3b，在盐浓度400 mmol/L时，设定pH=5.5的转换系数为1，pH转换系数为：

(2)

图5 不同盐浓度下(pH 4.0，聚合物浓度 0.5 mg/mL，I(M) 400 mmol/L)储存/损失模量曲线的时间-盐浓度叠加曲线的曲线作为参考(a)，不同盐浓度(pH 4.0，聚合物浓度 0.5 mg/mL)转换存储/损耗模量曲线的转换系数(b)，HA/CH复合物凝聚体的流变学数据的时间-pH叠加曲线(I(M) 400 mmol/L，聚合物浓度 0.5 mg/mL，pH 5.5的曲线作为参考(c)和HA/CH复合凝聚体流变学数据转换曲线的转换系数(I(M) 400 mmol/L，聚合物浓度 0.5 mg/mL)(d)Fig.5 Time-salt superposition of storage/loss modulus curves in different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL,curves in I(M) 400 mmol/L was chosen as reference)(a);transformation coefficient to shift storage/loss modulus curves in different salt concentration (pH 4.0,polymer concentration 0.5 mg/mL) (b); Time-pH superposition curves of rheology data for HA/CH complex coacervates (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL,curves in pH 5.5 was chosen as reference)(c);Shift factors to transform curves of rheology data for HA/CH complex coacervates (I(M) 400 mmol/L,polymer concentration 0.5 mg/mL)(d)

图5a、5c是通过缩放分析并引入合适的转换系数所获得不同盐浓度和pH下的G邈和G′的双对数图，横坐标为震荡频率，引入盐浓度转换系数fG,I(M)和pH转换系数fG,pH后可以观察到叠加曲线。可以看出缩放后所有的曲线形状相似，且可以较好的叠加在一起。缩放曲线的适用性意味着盐浓度和pH的变化在不改变基本机制的情况下影响结合强度。

用于创建主曲线的转换系数显示在图5b、5 d。转换系数fG,I(M)，fG,pH越接近1，意味着随着盐浓度和pH的变化影响越小，越大于1，HA/CH复合凝聚体的形成对于pH、盐浓度的改变越敏感[17]。转换系数的大小直观反映出HA/CH复合凝聚体对环境因素的敏感程度。

pH的改变会影响聚合物的电离，从而影响聚合物之间的相互作用[16]。由图5 d可以看出：pH在3.5-5.5之间越小时，HA/CH复合凝聚体表现出对于pH的变化越敏感。在高pH值下(接近于5.5)，聚阴离子HA和聚阳离子CH几乎完全电离，此时聚离子带电基团最多，电荷密度最大，极大增加了聚离子链之间的结合强度。

形成复合凝聚体是因为HA和CH上的相反电荷之间存在强烈的静电相互作用，但这些键作用力比较弱，它们可以被打开和重组。带相反电荷的聚离子链之间的离子键是暂时的，盐的添加会影响所有离子键的键能[20-21]，这是由于盐解离的阳离子和阴离子可以作为聚离子链的电荷补偿，降低HA/CH的结合强度，且体系内含水量会增加。由图5b可以看出：盐浓度越大，HA/CH复合凝聚体对盐浓度越敏感。总体而言，pH和盐浓度都影响CH和HA的结合，但不影响HA和CH的相互作用机制。

3 结论

(1)聚电解质复合物凝聚体的形成受到盐浓度和pH的强烈影响。

(2)pH在3.5～5.5变化时会影响聚离子的解离度，从而影响其带电密度，带电密度越高时，其聚离子的结合强度越强。

(3)盐的添加会影响离子键的键能，盐解离的阳离子和阴离子可作为聚离子链的电荷补偿，且盐的添加会降低HA/CH的结合强度。

(4)聚电解质电荷密度和盐离子的浓度均强烈影响聚电解质结合的速率，但不影响聚电解质复合凝聚时电荷之间键合基本机制。

(5)本文通过研究HA/CH复合凝聚体的流变性能来研究其内部相互作用，这种方法对于其他复合凝聚体材料的研究具有很好的参考价值。