CLDN4促进胃癌细胞增殖和侵袭能力

郑文英 杨文娟 邓敏(通讯作者)

510095广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所广州恶性肿瘤治疗转化医学重点实验室

胃癌的发病率居全球恶性癌症的第4位，死亡率在癌症中排第2 位。我国是胃癌发病率和死亡率最高的国家，并且发病率呈逐年增加趋势[1]，对人类健康造成严重威胁。胃癌目前的治疗方式主要是以手术为主，辅以化疗或放疗。手术是现在唯一可以根治胃癌的治疗手段，但是大部分胃癌被确诊已为中后期，且多发生转移，肿瘤发生全身转移常导致患者无法进行根治性手术，因此转移是导致患者死亡的主要原因之一。所以，针对胃癌早期诊断和转移机制的研究是临床非常重要的课题。CLDN4 属于紧密连接蛋白家族成员。研究发现，CLDN4 在包括食管癌、胃癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中存在高表达现象，并且其过表达与肿瘤预后不良相关[2]。本研究旨在研究CLDN4在胃癌的作用。

资料与方法

材料与试剂：人胃癌细胞系SGC7901、RPMI1640 培养基、小牛血清、Lipofectamine 2000 脂质体、TRIzol RNA 抽提试剂盒、RNA 逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR仪等。

图1 MTS 检测转染CLDN4 siRNA 及对照细胞的增殖情况

图2 transwell 细胞侵袭实验检测转染CLDN4 siRNA及对照细胞的侵袭能力

方法：①细胞培养：使用含有10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。细胞放置于37℃、5%CO2培养箱中培养。②细胞转染：将细胞转染前1 d 接种于6 孔板中，待贴壁细胞融合度达70%～80%时，用无血清培养基根据Lipofectamine 2000说明书进行转染。转染后6 h换新鲜完全培养基，继续扩大培养以用于后续实验。③qRT-PCR 检测：用TRIzol 提取细胞的总RNA，采用Takara 逆转录试剂盒按照说明书进行逆转录。PCR反应体系如下：2X SYBR Green Master mix 10 μL，PCR Forward Primer 0.5 μL，PCR Reverse Primer 0.5 μL，Cdna 2 μL，无酶水7 μL。采用ABI 7500 fast 实时定量PCR 仪进行PCR 反应，反应条件：Cycle 1：(1×)，95℃30 s；Cycle 2：(40×)，95℃5s，60℃30s。④MTS法检测细胞增殖活性：将细胞接种于96 孔板中，每组设6个复孔。细胞接种后24 h、48 h、72 h后分别加20 μL MTS检测试剂，37℃培养3 h，用酶标仪测定570 nm 波长吸光度值。⑤transwell细胞侵袭实验用胰酶消化细胞，用无血清培基重悬细胞，细胞计数。在transwell 下室加入含15% FCS 的培基700 μL。在transwell 上室加入细胞悬液250 μL，培养48 h，温度控制在37℃。取出transwell，擦掉靠上室侧膜的细胞，用10%福尔马林中固定10 min，结晶紫染色，显微镜细胞计数。

统计学方法：采用SPSS 19.0 统计学软件分析数据。计量资料(±s)表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

在SGC7901 细胞中转染CLDN4 siRNA 后，通过qRT-PCR 检测细胞CLDN4 表达水平，发现可转染CLDN4 siRNA 显著降低细胞CLDN4 表达水平，说明干扰效率高。检测转染CLDN4 siRNA 及对照细胞的增殖情况发现，转染CLDN4 siRNA 细胞较对照细胞增殖速度明显减慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。随后通过transwell 细胞侵袭实验检测各组细胞的侵袭能力，发现转染CLDN4 siRNA 细胞的侵袭能力显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。这些结果说明CLDN4 能促进胃癌细胞增殖、侵袭能力，见图1和图2。

讨 论

胃癌是人类十大恶性肿瘤之一，是消化系统最常见的恶性肿瘤，其死亡率在所有癌症中排第2 位，每年约有70 万人死于胃癌，严重威胁着人类健康。胃癌的发生发展机制尚不十分清楚，一般认为胃癌是一个涉及多步骤、多阶段、多基因改变的复杂过程，包括抑癌基因的失活、原癌基因的激活以及错配修复基因的突变等。胃癌的易感因素多种多样，主要是环境、遗传和行为三者之间的相互作用。关键的环境因素是慢性感染幽门螺旋杆菌，特别是CagA菌株。目前对胃癌具体发病及转移机制仍有很多尚待明确的地方。

已有研究显示，CLDN4 在胰腺癌中呈现高表达，并且与肿瘤分级有关[3]。然而在胰腺癌细胞过表达CLDN4 抑制癌细胞侵袭、转移能力。在胃癌，CLDN4 被发现高表达于幽门螺旋杆菌相关的胃癌，长期暴露于幽门螺旋杆菌可导致CLDN4 的上调。关于CLDN4 在胃癌发生发展中的作用鲜见报道。本研究在胃癌细胞中干扰CLDN4 表达，并检测胃癌细胞的增殖和侵袭能力。结果显示，干扰CLDN4 表达后胃癌细胞增殖和侵袭能力下降，表明CLDN4 能促进胃癌细胞增殖、侵袭能力。

综上所述，CLDN4 有望成为分子靶向治疗的有效靶点之一。