国产Bt-Cry1Ab和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾的抗性测定

张丹丹 吴孔明

摘要 草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）是世界性重大农业害虫。种植转基因Bt作物是主要的防治手段之一。我们利用室内生物测定方法评价了国产Bt-Cry1Ab玉米（转化体C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米（转化体DBN3601和DBN3608）对草地贪夜蛾1～4龄幼虫的毒力。结果显示，供试两种转基因玉米共6个品种皆可高效表达目标杀虫蛋白并对草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用，对1龄幼虫的致死率达到59%～100%，存活幼虫的生长发育亦受到显著抑制。表明国内研发的Bt-Cry1Ab玉米和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米对草地贪夜蛾具有良好的控制效果，其中Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米的防治效果顯著优于Bt-Cry1Ab玉米，两种转基因玉米皆具有较好的商业化应用前景。

关键词 草地贪夜蛾; Bt-Cry1Ab玉米; Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米; 控制效果

中图分类号： S 435.132

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019251

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda（J. E. Smith）是一种原分布于美洲大陆热带和亚热带地区的杂食性害虫[1]，其寄主植物多达76个科，353种[2]。同其他重大迁飞性农业害虫一样，具有“国际性、迁飞性、暴发性和毁灭性”的特点[3]，目前已成为世界范围内严重威胁粮食安全的重大生物灾害。其幼虫取食为害玉米，低龄幼虫取食玉米叶片可造成“窗孔”形症状。高龄幼虫除了取食叶片造成孔洞外，还为害心叶、叶鞘、雄穗和果穗等部位[4]，对玉米产量造成严重影响。据报道，20世纪60年代，在阿根廷东北部，草地贪夜蛾造成玉米产量损失高达70%。2000年，在阿根廷西北部地区，被草地贪夜蛾为害的玉米植株所占比例高达71%[5]。在巴西，草地贪夜蛾可使玉米减产34%，每年造成近4亿美元的经济损失[6]。2018年，在非洲西部的加纳，草地贪夜蛾造成玉米产量平均损失26.6%（最高40%），经济损失1.77亿美元，在非洲中南部的赞比亚，造成玉米产量平均损失35%（最高50%），经济损失1.59亿美元[78]。

化学防治是控制草地贪夜蛾为害的主要方法[9]，但由于草地贪夜蛾幼虫常在玉米叶背面和心叶里取食为害，高龄幼虫甚至会钻蛀到植株内部，使药剂无法充分接触到虫体，往往达不到良好的防控效果[10]。同时，随着化学杀虫剂的持续频繁使用，草地贪夜蛾种群逐渐产生了抗药性，据报道，在美洲部分地区，草地贪夜蛾已对氨基甲酸酯类、有机磷酸酯类和拟除虫菊酯类农药产生抗性[8]，导致化学防治效果不断降低。

随着科学技术的发展，转基因抗虫玉米的研发和商业化种植为控制草地贪夜蛾开辟了新途径，且已成为美洲大陆热带和亚热带地区防控草地贪夜蛾应用最广泛的技术手段。目前为止，表达Cry1F、Cry1Ab或Cry1A.105+Cry2Ab2蛋白的Bt玉米已在美国、加拿大和南美部分国家商业化种植，其中，Cry1F玉米‘TC1507的种植最为广泛[11]。在南非，2018年11月，草地贪夜蛾被列为表达Cry1A.105+Cry2Ab2蛋白的‘MON89034玉米（Bt2）的靶标害虫[12]。目前在美洲或非洲批准种植的转基因抗虫玉米有‘MON810、‘Bt11、‘MON89034、‘MON89034×TC1507、‘MIR162、‘Bt11×MIR162和‘MON810×TC1507×MIR162等，表达的蛋白类型有Cry1Ab、Cry1F、Cry2Ab2、Cry1A.105和Vip3Aa20[10]。

草地贪夜蛾于2019年1月侵入我国云南省[13]，截至5月10日，已在云南、广西、广东、贵州、湖南、海南、福建、浙江、湖北、四川、江西13省（区）261个县（市、区）发现其为害，总发生面积超过6.7万hm2，已对我国玉米生产构成重大威胁。根据取食寄主植物的嗜好性，草地贪夜蛾被分为喜欢取食玉米的“玉米型”和喜食水稻的“水稻型”[1415]。对入侵种群的分子鉴定结果显示，目前我国各地草地贪夜蛾均为玉米型[16]。为了发展防治草地贪夜蛾新技术，我们在室内利用人工接虫至玉米叶片的方法测定了国产Bt-Cry1Ab（转化体C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米（转化体DBN3601和DBN3608）对草地贪夜蛾1～4龄幼虫的抗性效果。

1 材料与方法

1.1 供试Bt玉米

Bt玉米由北京大北农生物技术有限公司提供，其中‘C0030.3.5-郑单958和‘C0030.3.5-农华106是Bt-Cry1Ab单基因抗虫玉米，‘DBN3601-郑单958、‘DBN3608-郑单958、‘DBN3601-农华106和‘DBN3608-农华106均是Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）双基因抗虫玉米，‘郑单958和‘农华106是对照常规玉米。所有玉米品种均置于温度为（26±1）℃的培养箱中培养。

1.2 供试虫源

供试草地贪夜蛾种群于2019年1月19日采自云南省德宏州鲜食玉米田，共采集100余头2～5龄幼虫，在室内用玉米叶片饲养至化蛹，成虫羽化后用10%的白糖水饲喂以补充营养和水分。成虫产卵后收集卵块，孵化后的幼虫用基于黄豆面和玉米面配制的人工饲料饲养，饲养至不同龄期的幼虫用于试验。所有幼虫和成虫均置于温度为（26±1）℃，湿度为60%±10%，光周期为L∥D=16 h∥8 h的培养箱中培养。

1.3 不同品种玉米叶片Cry1Ab和Vip3Aa蛋白表达量检测

利用ELISA方法检测玉米叶片中杀虫蛋白含量。取V2-2叶期的玉米植株顶端第二片叶，每个品种以5片叶为1个生物学重复，共设3个生物学重复，每个生物学重复设3个技术重复。新鲜玉米叶片用液氮在研钵内迅速研磨成粉末，加入提取液PBST（pH为7.4、浓度为0.01 mol/L的PBS+0.55% Tween 20），置于摇床上4℃过夜;12 000 r/min离心15 min，取上清液，用提取液适量稀释;将Cry1Ab和Vip3Aa标准品梯度稀释，在96孔酶标板每孔加入50 μL enzyme-conjugate Cry1Ab或Vip3Aa后，分别加入50 μL样品、阴性对照和标准品，用封口膜将酶标板封闭，轻摇混匀20～30 s，置于摇床上（200 r/min） 1～2 h;用力弃去液体后，每孔加入200 μL洗涤液，反复洗涤3次后用吸水纸吸干;每孔加入100 μL显色底物，用封口膜将酶标板密封，外覆锡箔纸避光，轻摇混匀20～30 s，室温放置15～30 min;每孔加入100 μL终止液终止反应，用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。

1.4 Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米对不同龄期草地贪夜蛾幼虫的抗性测定

抗虫性试验在玉米播种后10 d左右进行，在玉米生长期内，不接触其他任何杀虫物质。将新鲜的玉米植株插入盛有约2 cm高2%琼脂的玻璃指形管内（高12 cm，直径3.3 cm），将不同龄期幼虫接至玉米叶片上，1龄幼虫每株幼苗接5头，2龄、3龄和4龄幼虫为避免自相残杀对试验结果的影响，每株幼苗接1头，每个龄期50头幼虫为1个重复，设3个重复，共150头幼虫。指形管口用棉塞封闭防止幼虫钻出。然后置于温度为（26±1）℃，湿度为60%±10%，光周期为L∥D=16 h∥8 h的培养箱内。5 d后检查幼虫死亡率，用毛笔轻触虫体，不能正常爬行者视为死亡，并称取在不同玉米植株上存活下来的幼虫个体体重，计算体重抑制率。

1.5 数据处理与分析

根据试验数据，参照公式（1）和（2）计算各处理幼虫的校正死亡率，参照公式（3）计算体重抑制率。

死亡率=处理后死亡试虫数处理前供试总虫数×100%（1）

校正死亡率=处理组死亡率-对照组死亡率1-对照组死亡率×100%（2）

体重抑制率=（对照组体重增加值-处理组体重增加值）对照组体重增加值×100%（3）

采用SAS 9.2统计分析软件对所有数据进行方差分析，采用Duncan氏新复极差法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种玉米叶片中Cry1Ab和Vip3Aa蛋白含量

2种Bt-Cry1Ab玉米、4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米以及2个对照常规玉米叶片中Cry1Ab、Vip3Aa及总蛋白含量见表1。ELISA检测结果显示，2种对照常规玉米的Cry1Ab含量均< LOQ，2种Bt-Cry1Ab玉米的Cry1Ab含量为75.55～87.75 μg/g，二者之间无显著差异。而4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米Cry1Ab含量为86.05～101.64 μg/g，不同品种间也无显著差异，但除Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1（‘DBN3601-郑单958）外，其他3种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米Cry1Ab含量均显著高于Bt-Cry1Ab玉米-2。2种Bt-Cry1Ab玉米与2个对照常规玉米的Vip3Aa含量均< LOQ，4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米Vip3Aa含量为21.42～27.84 μg/g，彼此间无显著差异。2种Bt-Cry1Ab玉米与2个对照常规玉米总蛋白含量无显著差异，4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米中，Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-2总蛋白含量最高，为（406.74±8.66） mg/g，显著高于Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1，与其他2种无显著差异。

2.2 Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米对不同龄期草地贪夜蛾幼虫的抗性

2.2.1 不同龄期草地贪夜蛾幼虫取食Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米后的死亡率

不同龄期草地贪夜蛾幼虫取食Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米后的特征见图1。

室内玉米叶片生测结果显示：Bt-Cry1Ab玉米-1和Bt-Cry1Ab玉米-2饲喂的幼虫其校正死亡率呈现出随龄期增加而下降的趋势。其中，1龄幼虫的校正死亡率为59.23%～65.41%，2龄幼虫的校正死亡率为40.80%～47.89%，对3、4龄幼虫效果较差，校正死亡率仅为13.33%～34.14%。1、2、4龄幼虫在2种Bt-Cry1Ab玉米上校正死亡率无显著差异，3龄幼虫在Bt-Cry1Ab玉米-2上的校正死亡率（34.14%±7.32%）显著高于在Bt-Cry1Ab玉米-1上的校正死亡率（13.33%±0%）。

各龄幼虫在4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米上的校正死亡率均显著高于在两种Bt-Cry1Ab玉米上的校正死亡率，在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1、Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-2、Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-3和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-4上，1、2龄幼虫的校正死亡率均为100%±0%，3龄幼虫的校正死亡率分别为86.67%±6.67%、84.44%±2.22%、95.12%±2.44%和95.12%±2.44%，1～3龄幼虫在4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米上的校正死亡率之间没有显著差异。4龄幼虫的校正死亡率在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-4上最高，为77.27%±8.19%，显著高于在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-1上的校正死亡率53.02%±6.71%，后者与在Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-2和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米-3上的校正死亡率68.68%±2.24%和68.18%±6.01%無显著差异（图2）。

2.2.2 Bt-Cry1Ab和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米对不同龄期草地贪夜蛾幼虫体重的影响

用电子天平称取处理前及处理后5 d各龄期幼虫体重，因1龄幼虫太小，无法称取处理前及取食转Bt玉米后的体重，所以，该部分只分析了2、3和4龄幼虫体重。结果表明，转基因玉米能显著抑制幼虫体重增加，取食转基因玉米各龄期幼虫的体重均显著低于取食对照玉米的体重。Bt-Cry1Ab玉米-1和Bt-Cry1Ab玉米-2对2、3龄幼虫的体重抑制率可达92.62%～107.97%，对4龄幼虫的体重抑制率为59.50%～72.49%（表2）。在4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米上，2龄幼虫5 d后死亡率均为100%，故无法称取处理后体重。4种Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米对3龄幼虫的体重抑制率为109.12%～122.22 %，对4龄幼虫的体重抑制率为76.12%～92.43%。

3 讨论

李国平等研究发现Cry1Ab、Cry1F、Vip3A和Cry2Ab蛋白对入侵草地贪夜蛾具有较强的致死作用，而Cry1Ac的效果較差，因此种植Cry1Ab、Cry1F或叠加的Cry1Ab（或Cry1F）+Vip3A、Cry1Ab（或Cry1F）+Cry2Ab玉米可控制草地贪夜蛾的发生与为害[17]。本研究结果显示：取食Bt-Cry1Ab玉米，草地贪夜蛾幼虫的校正死亡率为13.33%～65.41%，体重抑制率为59.50%～107.97%。如取食Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米，校正死亡率为53.02%～100%，体重抑制率为76.12%～122.22%。表明Bt-Cry1Ab玉米和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米对草地贪夜蛾1～4龄幼虫均具有很好的防控效果，其中Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米的效果显著优于Bt-Cry1Ab玉米，供试Bt玉米对1、2龄低龄幼虫的防治效果均显著优于对3、4龄高龄幼虫的防治效果。

由于草地贪夜蛾的寄主作物较为广泛，生产上需要将Bt玉米和化学农药协同使用才能实现区域性防控的目标。赵胜园等的研究已表明，20%甲氰菊酯EC、15%唑虫酰胺SC和25 g/L溴氰菊酯EC等对草地贪夜蛾卵具有较高的毒杀活性，1%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐EC、5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐ME和75%乙酰甲胺磷SP等对草地贪夜蛾幼虫具有较强的毒杀作用[9]。因此，在实际生产过程中，可基于各地作物种植结构和草地贪夜蛾的发生规律，进一步构建这些高效化学农药和Bt玉米协同防控的技术体系。

虽然转基因抗虫玉米能够有效控制草地贪夜蛾的为害，但是同化学杀虫剂一样，随着Bt玉米的长时间、大规模种植，草地贪夜蛾在整个生长期就会持续处在Bt杀虫蛋白的选择高压下，这样就会逐渐演化出Bt抗性种群。波多黎各2003年开始商业化种植表达Cry1F的‘TC1507玉米，但2006年年底就发现草地贪夜蛾种群已对Cry1F玉米产生抗性[18]。2008年巴西首次引进Cry1Ab玉米（转化体MON810），3年后发现草地贪夜蛾对其产生抗性，2009年引进Cry1F玉米，仍是3年时间便产生抗性，2010年引进Cry1A.105+Cry2Ab2玉米，到2013年在田间形成了抗性种群[19]。Huang等先后报道美国东南部草地贪夜蛾种群对Cry1F蛋白和Cry1A.105蛋白产生了抗性[2021]。2017年，Chandrasena等研究发现阿根廷草地贪夜蛾种群对Cry1F产生抗性[11]。

国际上虽然提出了多种抗性治理策略，但以高剂量庇护所和多基因策略的应用最为广泛。在中国，采用“天然庇护所策略”有效延缓了棉铃虫对Bt棉花的抗性发展，利用“人工庇护所策略”有效延缓了红铃虫对Bt棉花的抗性发展，从而实现了Bt-Cry1A棉花的可持续种植[22]，这为Bt玉米的种植提供了成功经验。新杀虫蛋白的研发也为Bt抗性治理提供更多的策略，如Bt营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins，Vips），该蛋白是苏云金芽胞杆菌在对数生长期分泌产生的，与在芽胞形成期产生的Cry晶体蛋白无交互抗性。表达Vip3Aa20蛋白的转基因玉米已在美国、阿根廷和巴西等地商业化种植，该玉米可用于控制已对Cry杀虫蛋白产生抗性的草地贪夜蛾种群。到目前为止，在美洲众多商业化种植的Bt玉米中，草地贪夜蛾只对Vip3Aa20玉米仍然保持较高的敏感性，田间尚未发现该类玉米防治草地贪夜蛾失败的现象[19]。

中国已有多家公司成功研发了Bt抗虫玉米，我们对北京大北农生物技术有限公司研发的Bt-Cry1Ab（转化体C0030.3.5）和Bt-（Cry1Ab+Vip3Aa）玉米（转化体DBN3601和DBN3608）抗虫性的测定表明，中国已具备了研发和商业化种植转基因抗虫玉米的能力。鉴于草地贪夜蛾等鳞翅目害虫为害的严重性，应尽快推动转基因抗虫玉米的商业化进程，要用先进的技术手段服务和支撑中国农作物生产的高质量发展。

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（责任编辑：杨明丽）