先天性心脏缺损相关NR2F2基因新突变研究

先天性心脏缺损(CHD)是人类最多见的出生畸形，在新生儿中的发病率为1%左右，约占全部出生畸形的1/3[1]。严重CHD 可导致神经发育障碍或脑损伤、血栓栓塞、肺动脉高压、细菌性肺炎或心内膜炎、心功能不良或心力衰竭、房性或室性心律失常和心源性猝死等[1-3]。流行病学及医学遗传学研究发现CHD主要与遗传缺陷有关，在已经发现的60多个CHD致病基因中，大部分基因编码心脏转录因子[4]。最近的研究发现，心脏转录因子基因NR2F2突变可导致单纯型及综合征型CHD[5-8]。由于CHD具有显著的临床及遗传异质性[4]，有必要在不同CHD人群中研究NR2F2基因与CHD的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

自2015年4月至2017年12月入选了104例CHD患者和208名匹配的非CHD对照者，均来自中国上海地区汉族人群，均经询问病史及家族史、体格检查、常规化验检查和心脏彩色多普勒超声检查。在104例CHD患者中，男性61例，女性43例，年龄为1～12岁，平均年龄4岁，有阳性家族史者12例；在208名非CHD对照者中，男性122例，女性86例，年龄为1～11岁，平均年龄4岁，均无CHD患者家族史。经患者监护人知情同意后，收集患者外周静脉血约1 mL，使用血液DNA分离试剂盒(中国Sangon公司)提取基因组DNA。

1.2 方法

1.2.1 NR2F2基因扩增 扩增NR2F2基因编码区、剪接点及部分5′和3′端非翻译区所用的特异性引物序列见参考文献[6]。以基因组DNA为模板，使用热启动Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)和NR2F2基因扩增引物等试剂在PTC-220型PCR仪(美国MJ Research公司)上通过聚合酶链反应(PCR)扩增NR2F2基因片段。每一PCR反应物的总体积是50 μL，包括dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL、10×PCR缓冲液5 μL、基因组DNA(100 ng/μL)2μL、上游引物(20 μmol/L)1 μL 、下游引物(20 μmol/L)1 μL、热启动 Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL和双蒸水36.5 μL。PCR条件参考试剂说明书设定如下：共35个循环，每一循环包括98 ℃ 变性10 s、62 ℃退火30 s和72 ℃延伸1 min。PCR扩增的目的基因片段经过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离、回收后用凝胶纯化试剂盒(中国Sangon公司)纯化。

1.2.2 NR2F2基因测序分析 以上述纯化的目的基因片段为模板，使用正向或反向NR2F2基因特异性扩增引物和DNA循环测序试剂盒(美国Thermo Fisher公司)在ProFlex型PCR仪(美国Thermo Fisher公司)上进行测序反应。测序PCR混合物的总体积为20 μL，其中纯化的DNA片段(20 ng/μL)4 μL、预混合液8 μL、上游或下游引物(2 μmol/L) 1 μL、双蒸水7 μL。测序PCR的条件设置依据试剂说明书：共30个循环，每一循环包括95 ℃ 变性20 s、50 ℃退火15 s和60 ℃延伸1 min。测序PCR产物经过纯化后在3730 XL型DNA测序仪(美国Thermo Fisher公司)上进行测序。将所测出的NR2F2序列与Nucleotide数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)中的NR2F2序列(登陆号：NM_021005.3)进行对比分析以发现NR2F2基因变异。一旦发现NR2F2基因变异，就检索中外各数据库 (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php、http://gnomad.broadinstitute.org、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed、http://librarian.wanfangdata.com.cn)以确定所发现的基因变异是否有过报道。

1.2.3 突变位点氨基酸的保守性分析 通过Nucleotide数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)下载所有可获得物种的NR2F2蛋白之氨基酸序列，借助在线软件ClustalW2(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)评估突变氨基酸在物种进化上是否保守。

1.2.4 NR2F2基因变异的致病性分析 使用在线软件MutationTaster(http://www.mutationtaster.org)、PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和PROVEAN(http://provean.jcvi.org)分析所检测出的NR2F2基因变异是否具有致病性。

1.3 统计学分析

连续变量以均数±标准差表示，分类变量以个数或百分比表示。病例组与对照组间连续变量的比较使用Student′st检验；分类变量的比较使用Pearson′sχ2检验或Fisher′s精确概率检验。双侧检验值P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 发现NR2F2基因新突变

通过PCR-测序分析104例CHD患者的NR2F2基因，在其中1例家族史阴性的动脉导管未闭合并室间隔缺损患者发现了1个NR2F2基因杂合突变，其NR2F2基因编码核苷酸序列第1189位的胞嘧啶(C) 变为胸腺嘧啶(T)，即c.1189C>T突变，这导致NR2F2蛋白之氨基酸序列第397位的精氨酸(Arg)变为色氨酸(Trp)，即p.Arg397Trpr突变。该错义突变不存在于208名非CHD对照者。经过查询HGMD、genomAD、SNP、PubMed和万方数据库，均无NR2F2基因c.1189C>T变异报道，表明该NR2F2基因c.1189C>T突变是1个新突变。NR2F2基因c.1189C>T杂合突变及其纯合野生型碱基序列见图1。

注：箭头所指分别为NR2F2基因c.1189C>T杂合突变型T/C和纯合野生型C/C序列

2.2 突变位点氨基酸在多物种进化上保守

NR2F2蛋白序列与已知物种包括人、大猩猩、猴、狗、牛、小鼠、大鼠、禽、斑马鱼、果蝇、蚊虫和蟾蜍等的NR2F2蛋白序列比对分析表明，第397位的精氨酸在多物种进化上完全保守。多物种NR2F2蛋白之氨基酸序列比对分析结果见图2。

注：箭头所指为NR2F2蛋白之氨基酸序列第397位的精氨酸

2.3 NR2F2基因

c.1189C>T突变有致病性，该NR2F2基因c.1189C>T突变被MutationTaster软件预测为致病性突变，预测结果正确的概率值约为1.00；被PolyPhen-2预测为致病性突变，预测值为1.00(敏感性为0，特异性为1.00)；被PROVEAN预测为致病性突变，预测值为-5.68。

3 讨论

本研究在1例散发性动脉导管未闭合并室间隔缺损患者中识别出了1个新的NR2F2基因杂合错义突变c.1189C>T(p.Arg397Trp)，但该杂合错义突变不存在于208名非CHD对照者。该突变位点上的精氨酸在人、大猩猩、猴、狗、牛、小鼠、大鼠、禽、斑马鱼、果蝇、蚊虫和蟾蜍等物种进化上完全保守，而且在线计算机功能预测分析软件MutationTaster、PolyPhen-2和PROVEAN均预测该突变是致病性突变。因此，NR2F2基因c.1189C>T(p.Arg397Trp)突变极有可能是该CHD患者的分子病因，但该基因突变的致CHD机制仍需进一步研究。

NR2F2基因定位于人15号染色体15q26.2，编码一种由414个氨基酸残基所组成的转录因子蛋白，即核受体2亚族F组2号成员(NR2F2)，也被称作鸡卵上游启动子转录因子2(COUP-TFII)[6]。NR2F2对胚胎期心血管的正常发育具有重要的调控作用，主要是在胎儿心脏通过与其转录合作伙伴如GATA4调节多个关键基因如ANF的表达而实现的[6]，而GATA4是重要的CHD致病基因，已经发现越来越多的GATA4突变可导致CHD[4]。因此，NR2F2基因突变可能通过影响NR2F2并与GATA4一起协同调节心脏发育关键靶基因的表达而导致CHD。

NR2F2大量表达于小鼠胚胎心脏，NR2F2基因敲除可因心血管发育异常导致小鼠胚胎期死亡，主要表现有严重出血以及心房和静脉窦不能发育到原始心管阶段[9]。另外，内皮特异性敲除NR2F2可因可导致多种心血管发育畸形，包括左房发育不良、心室发育不良、心内膜发育不良、房室间隔缺损和冠状动脉畸形[10]。这些动物实验结果表明NR2F2在心血管正常发育方面有重要作用。

NR2F2大量表达于人类胚胎心脏的心房、主动脉和冠状动脉，NR2F2基因突变可导致室间隔缺损、房室间隔缺损、主动脉缩窄、法洛四联征、主动脉狭窄和左室发育不良综合征[5]。Qiao等[6]等报道NR2F2基因突变导致右心室双流出道合并室间隔缺损。Bashamboo等[7]等报道NR2F2基因突变可导致睾丸和心脏发育畸形，而Upadia等[8]报道NR2F2基因突变可导致心脏和面部发育畸形。本研究发现，NR2F2基因突变导致动脉导管未闭合并室间隔缺损，扩大了NR2F2基因相关的表型谱，进一步显示NR2F2缺陷的致CHD作用。