HMGB1在哮喘大鼠气道炎症中的作用及苗药热咳喘胶囊干预效果

张永平，吴琴琴，徐 丽，李 琴，余慧娟

(贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003)

支气管哮喘(Bronchial Asthma)是一种由T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和中性粒细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病。气道炎症是其最为重要的病理特征之一，是目前公认的支气管哮喘发病的重要因素。HMGB1是一个新近发现的具有显著促炎作用的炎症因子，与多种炎症性疾病的病理生理过程息息相关。有临床研究报道，在哮喘患者的痰和血浆中HMGB1的水平明显增加，且痰中HMGB1的表达水平与肺功能指标呈明显的负相关，这提示HMGB1可能参与了哮喘气道慢性炎症反应的过程[1]。苗药热咳喘胶囊由贵州中医药大学第二附属医院治疗哮喘经验方所制成，经长期临床运用，疗效显著。本研究通过观察哮喘大鼠肺泡灌洗液中EOS、NEU的计数及HMGB1含量，以了解HMGB1与哮喘气道炎症的相关性及苗药热咳喘胶囊对HMGB1的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性健康清洁级SD大鼠40只，体重 120～140 g，月龄6～9个月，由贵州中医药大学动物实验中心提供，饲养实验室采光、通风良好，室温(22±2) ℃，湿度为 60%～70%，自由进食、饮水，自由活动，分笼饲养，正常饲养5天后，观察各笼大鼠无异常表现。

1.1.2 药物及试剂 苗药热咳喘胶囊由贵州中医药大学第二附属医院药剂科制备：全瓜蒌(真花休)15 g、法夏(科辣)12 g、黄芩(额嘎)15 g、百部(窝嘎单里、锐败呆)15 g、炙僵蚕(岗阿大) 15 g、地龙9 g、青黛6 g、蛤粉6 g、橘红12 g、炒葶苈子12 g、杏仁10 g、桑白皮12 g、紫苑15 g、天竺子10 g、麻黄10 g、炙甘草10 g，上方醇提制成胶囊剂，每粒含生药2.76 g。0.9%氯化钠注射液500 mL(贵州科伦药业有限公司，批号：A14122812-2)，醋酸地塞米松注射液5 mg(贵州光正制药有限责任公司，批：140828)，OVA(美国Sigma公司)，Al(OH)3(上海分工生产)，灭活百日咳杆菌疫苗(北京生物制品研究所)，磷酸缓冲液(PBS)北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 光学显微镜(日本OLYMPUS公司)，大鼠HMGB1 ELISA试剂盒96T(北京中衫金桥生物技术有限公司)，两用型水箱(BDS北京医疗器械设备厂)，自制塑料雾化箱30 cm×30 cm×45 cm，电热恒温水箱(HHW21420型湖北亚光医用电子技术有限公司)，手术中所用的器械(止血钳、镊子、眼科剪等贵州中医药大学北校区实验室)，医用超声雾化器贝尔斯BSW-2A(河北贝尔斯科技有限公司)，普通冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司)，电子天平(JY2001上海浦春计量仪器有限公司)，-4 ℃低温冰箱(Thermo Scientific公司)。

1.1.4 动物分组 40只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、苗药热咳喘胶囊组、地塞米松组，每组各10只。

1.2 研究方法

1.2.1 哮喘模型建立 除正常对照组外，参照吕国平等人[2]的方法，并加以改进进行造模。实验第1天，大鼠腹腔注射10%卵蛋白生理盐水抗原液(内含卵蛋白OVA100 mg，氢氧化铝(Al(OH)3)100 mg，灭活百日咳菌苗5×109个)1 mL进行致敏，第8天重复上述操作。第15天腹腔注射后将大鼠放到雾化箱中，采用浓度为5% OVA溶液15 mL以超声雾化吸入的方式激发大鼠哮喘发作，每天激发1次，每次持续时间为30 min，共激发7天。大鼠逐渐出现呼吸急促、烦躁不安、弓背、抽搐或者跌倒等症状，说明哮喘模型激发成功。

1.2.2 给药方法 正常组：第1天、第8天、第15天腹腔注射生理盐水1 mL，第15天开始每次激发前1 h予生理盐水3 mL灌胃，连续7天；模型组：第15天开始每次激发前1 h予生理盐水3 mL灌胃，连续7天；地塞米松组：第15天起开始每次激发前1 h予醋酸地塞米松注射液50 μg/mL 3 mL(根据人鼠使用剂量换算，按1 mg/kg/d)腹腔注射，疗程为2周；苗药热咳喘胶囊组：按照人鼠用药剂量换算，第15天起每次激发前1h予热咳喘胶囊2.10 g/kg，予热咳喘胶囊粉配制后灌胃，3 mL/只/次，疗程为2周。

1.2.3 BALF的提取 每组大鼠在疗程结束后，腹腔注射10%水合氯醛以0.35 mL/100 g进行麻醉，麻醉好后，将大鼠仰卧固定于固定架上，股动脉放血处死，酒精消毒颈部及胸部，在超净工作台内以无菌器械打开胸腔，完整分离心肺，分离气管及左、右主支气管，并结扎右侧主支气管。在气管的第二、三软骨环间做一个横行切口，置入连接注射器的硅胶管，然后用“0”号手术线结扎固定，用一次性注射器将2.5 mL生理盐水缓慢注入气管和左侧肺当中，气管插管约0.5 cm，停留约30 s后缓慢抽回，以上动作重复操作5次，最后将5次抽取的BALF混合(回收率在85%以上为合格)。在4 ℃低温下10 000 rpm离心5 min，取上清液后放至-4 ℃冰箱保存。

1.2.4 BALF中EOS及NEN计数 将正常组及模型组支气管肺泡灌洗液细胞沉淀从-4 ℃冰箱取出，先用磷酸缓冲液(PBS)重悬BALF细胞悬液，然后取出来50 μL进行涂片，在涂片干燥以后再进行瑞氏(Wright-stain)染色，然后计数200个白细胞作分类计数，至少进行4个视野的计数(在光学显微镜下)，将细胞分为EOS、NEU、淋巴细胞和单核巨噬细胞(依据形态学特点)，最后计算BALF中EOS及NEU数量。

1.2.5 BALF中HMGB1含量的测定 正常组、模型组、苗药热咳喘胶囊组及地塞米松组均根据双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒说明书进行操作，依据吸光度OD值计算出BALF标本中HMGB1的含量。

1.2.6 统计学分析 实验数据采用SPSS19.0统计软件进行处理，所有结果以均数±标准差进行表示，以P<0.05表示差异有统计学意义。如果是多组正态资料的均数比较选方差分析，如果是两两多重比较选LSD法。

2 结果

2.1 肺泡灌洗液中EOS、NEU计数及HMGB1含量

正常组与模型组肺泡灌洗液中EOS、NEU计数及HMGB1含量比较，正常组均明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

组别nEOS(×109/L)NEN(×109/L )HMGB1(μg/L)正常组100.09±0.0091.20±0.4223.726±1.320模型组100.29±0.023▲6.40±1.838▲14.658±0.843▲

注：与正常组比较，▲P<0.05。

2.2 肺泡灌洗液中HMGB1含量

与正常组比较，模型组、苗药热咳喘胶囊组、地塞米松组BALF中HMGB1含量明显高于正常组，具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，苗药热咳喘胶囊组、地塞米松组均明显低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；与苗药热咳喘胶囊组比较，地塞米松组低于苗药热咳喘胶囊组，但差异无统计学意义(P>0.05)。 BALF中HMGB1含量结果从高到低依次为：模型组、苗药热咳喘胶囊组、地塞米松组、正常组。见表2。

组别nHMGB1含量正常组模型组苗药热咳喘组地塞米松组101010103.726±1.32014.658±0.843▲5.895±0.929▲●5.459±0.842▲●Δ

注：与正常组比较，▲P<0.05；与模型组比较，●P<0.05；与苗药热咳喘胶囊组比较，ΔP>0.05。

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症性疾病，伴有气道高反应性、气道阻塞和气道重塑[3]。其基本特征是气道高反应性炎症、微血管渗漏、黏液分泌增加和平滑肌收缩所导致的可逆性气道阻塞及气道高反应性。气道的慢性炎症反应促使气道结构改变，最终导致气道重塑使哮喘症状发生及进一步发展[4]。而气道慢性炎症以EOS浸润为主，EOS是支气管哮喘气道炎症中十分关键的效应细胞，EOS能够在气道中聚集并活化进而引起哮喘的发病。而HMGB1是一种重要的炎症介质，近年来研究显示HMGB1可能参与多个呼吸系统疾病的病理生理过程，在哮喘等慢性炎症气道疾病的地位也越来越受到人们的重视[5]。有文献报道，HMGB1可以使EOS活化，并能够提高EOS的存活时间[6]。有临床研究报道，在哮喘患者的痰和血浆中HMGB1的水平明显增加，且痰中HMGB1的表达水平与肺功能指标呈明显的负相关，这提示HMGB1可能参与了哮喘气道慢性炎症反应的过程[1]。

苗药热咳喘胶囊是贵州中医药大学第二附属医院治疗支气管哮喘的经验方，多年来临床实践证实对治疗哮病热哮证有显著疗效。经现代药理学研究证实，方中瓜蒌提取物中天门冬氨酸能增强细胞免疫活性，减轻炎症反应，减少痰液的分泌，半胱氨酸能裂解痰液黏蛋白，使痰液变稀促进痰液排出[7]。麻黄中含有较多麻黄碱，伪麻黄碱能缓解支气管平滑肌痉挛[8]。地龙富含氨基酸及多种矿物质和微量元素，能显著增强细胞表面Fc受体的功能，可以阻止EOS激活[9]。桑白皮在呼吸系统表现为抗炎、镇咳、祛痰、平喘的作用[10]。苦杏仁中所含的苦杏仁苷分解出来的氢氰酸能够使呼吸加深，使咳嗽减轻[11]。葶苈子内的苄基芥子油具有抗菌作用，能够缓解平滑肌痉挛[12]。半夏所含β-谷甾醇具有止咳、抗癌、抗炎及降低血液中胆固醇的作用，可以减少支气管分泌物从而起到镇咳祛痰的作用[13]。黄芩能不同程度抑制细菌和病毒，也能够提高机体的杀菌力[14]。黄芩、百部共用能够使黄芩总黄酮和黄芩苷的含量增多，进而增强清热、抗炎的作用。蛤粉富含丰富的氨基酸和多种微量元素，如谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸及钙、锌、铁等，且蛤蚧身和尾的醇提取物具有明显抗炎、解痉、平喘作用。橘红中的橘红多糖可以止咳化痰。百部主要成分为百部碱，有中枢性镇咳的作用，其作用强度与氨茶碱类似，缓慢而持久。现代药理研究表明，甘草具有抗炎、抗氧化、抗病毒、治疗多种呼吸系统疾病、调节内分泌、增强免疫功能等功能，还能保护发炎的咽喉和气管黏膜。

本研究结果表明，模型组肺泡灌洗液中EOS、NEU计数及HMGB1含量均明显高于正常组，苗药热咳喘胶囊组、地塞米松组肺泡灌洗液中HMGB1含量明显低于模型组，以上说明HMGB1与哮喘发生相关，其可能参与了哮喘气道炎症的形成，苗药热咳喘胶囊和地塞米松均能抑制哮喘大鼠气道中HMGB1的表达。由于时间和大鼠样本量有限，故本研究结果仍需大样本的随机对照研究加以证实。