免疫性血小板减少症患者血小板COX-1和COX-2的表达及意义

叶加建 吴定昌 汤忠秀 李丽丽

(福建省老年医院检验科,福州 350003)

免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia purpura，ITP)是一种最常见的自身免疫性出血性疾病，主要临床表现为血小板数目减少[1]。目前关于ITP发病机制尚未完全清楚，以往研究认为抗原特异性自身抗体介导的血小板破坏从而引起血小板减少症[2]。ITP患者产生的血小板更大且更不成熟，而多数抗体易与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa结合[3]。研究表明环氧化酶-1(Cyclooxygenase-1，COX-1)在调节血小板聚集方面发挥重要作用[4]。环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)与GPⅡb/Ⅲa及P-选择素水平变化与血小板活化有关，且血小板浓度与聚集率之间呈正相关[5]。目前关于COX-1、COX-2在ITP患者血小板中表达的研究相对较少，本研究拟通过流式细胞术检测ITP患者富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)中COX-1、COX-2的表达及其意义，为临床指导个体化抗血小板治疗提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1主要仪器及试剂 全血自动血细胞分析仪购自美国库尔特公司，Coulter Epics XL MCL flow cytometer流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司，IsotonⅢ试剂购自美国Beckman Coulter公司，PE-CD42b抗体购自美国Becton Dickinson公司，FITC-COX-1与FITC-COX-2抗体购自美国Cayman Chemical公司，鼠抗人IgG、IgM、IgA一抗购自法国Immunotech公司。

1.1.2临床资料 选择2015年3月至2017年2月于我院诊治的65例免疫性血小板减少症患者为研究组，另选取同期于我院进行体检的健康献血者61例为对照组。收集两组受试人员的一般资料包括年龄、性别等。纳入标准:①免疫性血小板减少症患者符合相关诊断标准[6]；②ITP患者均未接受过血小板输注与脾切除治疗；③未服用影响凝血功能药物者；④患者知情且签署同意书。知情同意书主要内容包括研究背景、目的、不易参与人群、参加研究可能受益项及风险、不良反应及相关费用情况等。排除标准:①自身免疫性疾病患者；②精神病患者；③恶性肿瘤患者；④正在参加其他临床试验者；⑤有血液系统疾病史者。两组研究对象年龄、性别等一般资料比较差异无统计学意义，具有可比性。

1.2方法

1.2.1样本采集 两组研究对象均于次日清晨采集空腹静脉血3 ml并置于3.2%枸橼酸钠抗凝管内，1 h内将其置于离心机转速为200 r/min离心4 min，以此获得PRP。

1.2.2标记COX-1、COX-2 分别将PRP置于3个EP试管内，每支试管装25 μl，并将100 μl IsotonⅢ加入其中两支试管，之后加入PE-CD42b抗体室温下避光孵育，20 min后加入1%多聚甲醛固定10 min，然后用0.1%TritonX-100破膜，10 min后分别加入5 μl FITC-COX-1与FITC-COX-2抗体并避光孵育，20 min后采用1%多聚甲醛固定10 min，另外一支未加抗体的EP试管作为阴性对照。其中PE-CD42b可特异性识别血小板膜糖蛋白，因而双阳性检测结果可特异性反映血小板内COX-1、COX-2表达。

1.2.3标记血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)与血小板相关抗体 50 μl血小板悬浮液中分别加入IgG1PEE/IgG1FITC(10 μl)与CD41/CD61(10 μl)，并将其置于室温静置15 min后上机检测。IgG、IgM、IgA单克隆抗体5 μl分别加入测定试管中，室温静置15 min后加入FITC标记羊抗鼠IgG，PBS清洗后上机检测。

1.2.4流式细胞仪检测 将处理好的血标本于2 h内在流式细胞仪上检测与分析，根据前群及侧群的分布确定血小板的位置(门)并对门、电压及补偿进行调整，计数1×104个血小板并记录其荧光标记抗体的阳性百分比即为COX-1、COX-2表达。

1.2.5观察指标 运用血细胞自动分析仪检测抗凝试管内静脉血的血小板参数并观察血小板参数的变化，包括血小板计数(PLT)、血小板比积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)。

2 结果

2.1两组临床资料的比较 研究组PLT、PCT、PDW、GPⅡb/Ⅲa显著低于对照组(P<0.05)，而MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA明显高于对照组(P<0.05)，详见表1。

2.2两组血小板COX-1、COX-2表达的检测结果 两组血小板COX-1、COX-2表达存在明显差异，研究组患者血小板内COX-1、COX-2阳性百分比均显著高于对照组(P<0.05)，详见图1、表2。

Tab.1 Comparison of clinical data between two groups

ClinicalindicatorsControlgroup(n=61)Researchgroup(n=65)χ2/tPAge47.58±7.9348.02±8.030.3090.758Gender(n)0.3420.559Male2530Female3635Platelet parametersPLT(×109 L-1)125.36±20.0162.58±2.2325.1360.000MPV(fl)6.23±1.0410.21±1.0321.5750.000PCT(%)1.25±0.230.34±0.0431.4040.000PDW15.23±2.0112.72±1.617.7590.000Platelet-associated antibodyPAIgG(%)11.48±3.8229.21±9.7313.3000.000PAIgM(%)9.58±3.1923.57±7.8612.9350.000PAIgA(%)7.54±1.2621.34±7.1114.9370.000GPⅡb/Ⅲa(%)93.27±31.0967.78±22.535.2930.000

图1 流式细胞术检测血小板内COX-1和COX-2的表达Fig.1 Flow cytometry to detect the expression of COX-1 and COX-2 in plateletsNote: A,B. The control group and the research group COX-1 respectively;C,D. The control group and the research group COX-2 respectively.

GroupsnCOX-1COX-2Control group6115.21±1.2318.34±2.36Research group6542.35±3.571)66.18±12.671)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

2.3血小板COX-1、COX-2表达与患者临床指标的关系 Pearson法分析免疫性血小板减少症患者血小板内COX-1、COX-2表达与患者临床指标的相关性，结果显示COX-1、COX-2均与MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA呈正相关，而均与PLT、PCT、GPⅡb/Ⅲa呈负相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

2.4ROC分析血小板COX-1、COX-2对免疫性血小板减少症的诊断价值 ROC分析结果显示COX-1的敏感度为69.23%、特异度为90.62%、截断值为17.63，COX-2的敏感度为78.46%、特异度为84.37%、截断值为23.95，详见图3、表4。

2.5免疫性血小板减少症发生的相关因素分析 将影响免疫性血小板减少症发生的相关因素进行Logistic分析，结果显示MPV、PCT、PAIgG、PAIgA、GPⅡb/Ⅲa、COX-1与COX-2均为免疫性血小板减少症发生的危险因素，详见表5。

表3 患者血小板COX-1、COX-2表达与血小板参数的关系

Tab.3 Relationship between expression of COX-1 and COX-2 and platelet parameters in patients with platelets

PlateletparametersCOX-1rPCOX-2rPPLT-0.2720.029-0.3500.004MPV0.5790.0000.7110.000PCT-0.2880.020-0.4440.000PDW-0.1130.372-0.1740.165PAIgG0.3010.0150.4530.000PAIgM0.2680.0310.4970.000PAIgA0.4460.0000.5280.000GPⅡb/Ⅲa-0.5430.000-0.6400.000

图3 免疫性血小板减少症血小板COX-1和COX-2的ROC分析Fig.3 ROC analysis of platelet COX-1 and COX-2 in immune thrombocytopenia

表5 影响免疫性血小板减少症发生的相关因素的多因素分析

Tab.5 Multivariate analysis of factors affecting the occurrence of immune thrombocytopenia

Influencing factorβSEWald/χ2POR95%CIAge0.3040.2122.0500.3761.3551.123～1.634Gender0.4990.3202.4270.2681.6461.347～2.012MPV1.0070.4365.3360.0242.7382.182～3.435PCT0.9730.4285.1650.0372.6451.765～3.964COX-11.0730.4136.7460.0132.9232.124～4.023COX-21.1420.4028.0690.0023.1332.247～4.368PAIgG1.0770.4336.1840.0112.9352.147～4.013PAIgM0.7970.4413.2650.3582.2191.847～2.665PAIgA1.0470.4375.7420.0222.8502.024～4.012GPⅡb/Ⅲa0.7640.3126.0000.0152.1471.748～2.638

表4 免疫性血小板减少症血小板COX-1和COX-2的ROC分析

Tab.4 ROC analysis of platelet COX-1 and COX-2 in immune thrombocytopenia

IndexAUCStandard errorZ statistics95%CIPCOX-10.8500.03410.260.777～0.907<0.000COX-20.7930.0417.1410.713～0.860<0.000

3 讨论

ITP主要由机体多种免疫功能异常导致血小板破坏增加或生成减少所致，严重时危及生命安全[7]。以往研究认为血小板活性增强与机体免疫系统紊乱在ITP的发病中发挥重要作用[8,9]。机体免疫系统紊乱导致患者体内抗血小板抗体与血小板结合进而破坏网状内皮系统并导致血小板数量减少[10]。研究表明抗血小板药物可促使COX-1乙酰化并减少花生四烯酸代谢产物血栓素A2的产生进而抑制血小板凝集[11]。相关研究显示，COX-1、COX-2基因多态性在血小板活性增强、抗血小板过程中具有关键作用。当前临床通过排除其他引起的血小板减少症病因进行ITP诊断，且缺乏敏感性及特异性的诊断指标。因此，本研究分析血小板COX-1、COX-2在免疫性血小板减少症中的临床应用价值。

COX-1可在花生四烯酸生物合成前列腺素过程中发挥重要作用，研究表明恶性肿瘤组织中COX-1表达水平显著升高并可作为诊断疾病的重要指标[13]。原发性血小板增多症患者COX-1表达与其在健康个体内的表达并无明显差异[14]。本研究采用流式细胞术检测所有研究对象血小板内COX-1表达水平，结果显示研究组患者血小板内COX-1表达显著高于对照组，这可能是由于ITP患者血小板破坏程度增加所致[15]。血小板参数可反映血小板生成与衰亡，其中PLT是监测凝血状况的常规指标，PCT与PLT变化基本一致，MPV可反映骨髓中巨核细胞代谢及血小板生成情况，PDW可反映血小板大小的异质性及分布的趋势[16]。与此相似，本研究结果也显示研究组患者PLT、PCT、PDW均显著低于对照组，而MPV显著高于对照组，此外研究组GPⅡb/Ⅲa显著低于对照组，而PAIgG、PAIgM、PAIgA明显高于对照组，进一步进行相关性分析显示COX-1表达与MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA呈显著正相关，而与PLT、PCT、GPⅡb/Ⅲa呈显著负相关，说明COX-1参与ITP疾病发生过程。提示COX-1异常并通过与自身血小板抗原作用促使机体产生相应抗体从而激活B淋巴细胞最终导致ITP患者病情加重。

COX-2是一种诱导酶并可通过MAPK依赖的磷酸化途径抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPAR-γ)表达进而引起Th细胞亚群紊乱[17]。相关研究表明Treg/Th17细胞平衡失调可能引发原发免疫性血小板减少症并可促进疾病的发生发展[18]。本研究结果显示研究组患者血小板内COX-2阳性百分比显著高于对照组，与文献报道相似[19]，说明ITP患者血小板内COX-2呈高表达。分析其原因可能为COX-2高表达可造成细胞免疫功能紊乱，同时可通过T细胞介导的细胞毒作用直接破坏血小板进而导致血小板破坏增加。观察COX-2表达与ITP患者临床指标的关系，结果显示COX-2与MPV、PAIgG、PAIgM、PAIgA呈显著正相关，而与PLT、PCT、GPⅡb/Ⅲa呈显著负相关，说明COX-2与ITP发生及血小板代谢密切相关。提示COX-2通过引发机体免疫功能异常并促使抗体水平升高从而促使GPⅡb/Ⅲa减少，并可抑制其黏附、聚集功能导致ITP的发生。

既往检测COX-1、COX-2多采用酶联免疫吸附法，或Western blot方法检测血小板COX-1、COX-2蛋白水平，但对血小板极少的患者检测结果存在较大偏差，且操作过程中易破坏和激活血小板[20]。本研究通过流式细胞术检测COX-1、COX-2表达并采用ROC法分析显示COX-1与COX-2具有较高的灵敏度与特异度，说明COX-1与COX-2在ITP的诊断中具有较高的应用价值，且二者的截断值可作为阳性诊断界值进而提高ITP诊断的敏感性及特异性。说明COX-1与COX-2共同作用并可反映免疫性血小板减少症的进展情况，分析原因可能为ITP患者血小板COX-1与COX-2异常表达可促使细胞免疫功能紊乱进而影响血小板的正常代谢。同时本研究将影响ITP疾病发生的相关因素进行Logistic分析，结果显示COX-1与COX-2均为免疫性血小板减少症发生的危险因素。本研究结果揭示通过流式细胞技术检测血小板COX-1、COX-2蛋白水平可有效反映ITP患者的疾病状态并为临床疾病诊断提供重要的参考依据。

综上所述，ITP患者血小板COX-1与COX-2均呈高表达，二者呈显著正相关关系且共同参与ITP疾病发生及进展过程，血小板COX-1与COX-2表达异常在ITP发病过程中可能发挥重要作用。关于血小板COX-1与COX-2在ITP发病中的作用机制将有待进一步研究。