淋巴毒素β受体、TIPE2和可溶性PD-1分子在类风湿性关节炎患者中的表达及其临床意义①

冯秀南 姜振宇

(吉林大学第一医院风湿免疫科，长春 130021)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是常见的一种慢性自身免疫性疾病，临床调查显示我国患者患病率为0.4%左右，以关节外病变、多滑膜关节炎等为主要临床表现，严重影响人们身心健康和生活质量[1,2]。目前，对于RA具体发病机制尚未完全阐明，临床上仅对症治疗，大部分无法彻底治愈疾病[3]。因此，分析RA的发病机制，寻找新的有效的治疗靶点，仍为临床工作者迫切需要解决的问题。淋巴毒素β受体(LTβR)是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，研究发现其与自身免疫密切相关[4]。TIPE2属肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8家族的一员，是新发现的一种免疫负调控因子，其在多种人类自身免疫性疾病中异常表达[5]。近年来，可溶性PD-1分子(sPD-1)成为免疫学研究的热点，有望成为自身免疫性疾病治疗的有效靶分子[6]。因此，本文研究旨在探讨LTβR、TIPE2和sPD-1在RA患者中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料 选择吉林大学第一医院于2017年5月至2018年5月期间收治的RA患者93例作为研究组，依据《类风湿关节炎诊断及治疗指南》[7]中关于RA诊断标准：①关节内或关节周围晨僵，且每日持续1 h以上，持续6周以上；②类风湿性因子阳性；③ 3个或者3个以上关节，且同时出现肿胀或积液；④影像学检查：手及腕部前后位摄片显示有骨质疏松或骨质侵蚀。纳入的93例患者中，男57例，女36例；年龄41～75岁，平均年龄(59.98±4.61)岁；其中急性活动期54例，缓解期39例。另选择同期收治的骨关节炎(Osteoarthritis，OA)患者61例作为对照组，其中男35例，女26例；年龄40～75岁，平均年龄(60.13±5.34)岁。两组性别、年龄一般资料具有可比性(P>0.05)，差异无统计学意义。所有研究对象均经吉林大学第一医院伦理委员会批准，且获得知情同意。

1.1.2主要试剂与仪器 荧光定量PCR仪、RNA分离试剂盒、TaqMan PCR主要混合物、SYBR Green实时荧光定量 PCR 预混液、DEPC水、实时荧光定量PCR检测试剂盒均购自美国Bio-Rad公司，PCR引物由上海生工生物工程(股份)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有研究对象采集关节腔积液，行关节腔穿刺，抽取患者关节腔积液2 ml，2 500 r/min，离心10 min，分离关节腔积液，放置于-20℃下保存待测。

1.2.2荧光定量PCR检测LTβR、TIPE2和sPD-1表达 采集患者关节腔积液提取总RNA，提取方法为经典的异硫氰酸胍法，严格依据总RNA抽提试剂盒说明书标准进行总RNA的提取，彻底干燥，溶解于DEPC 处理水20 μl中，取11 μl总RNA用于cDNA的合成，严格参照cDNA第一链合成试剂盒说明书进行具体操作，总反应体系为20 μl，将得到的cDNA放置于-70℃下保存待测。取2 μl用于实时荧光定量PCR扩增。对LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA进行PCR反应条件的优化，检测样本LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA相对表达量，以GAPDH mRNA作为内参，以2-ΔΔCt的相对定量法计算LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA相对表达量。引物序列采用Primer Premier 6.0软件自行设计，均符合荧光定量PCR引物的要求。见表1。

2 结果

2.1两组患者关节腔积液中LTβR、TIPE2和sPD-1 mRNA相对表达量比较 见表2。研究组关节腔积液中LTβR和sPD-1 mRNA相对表达量高于对照组，而TIPE2 mRNA相对表达量低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2RA不同特征关节腔积液中LTβR mRNA相对表达量比较 见表3。不同性别和年龄关节腔积液中LTβR mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；急性活动期关节腔积液中LTβR mRNA相对表达量高于缓解期，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 引物序列

Tab.1 Primers of RT-PCR

GeneSequence of primersLTβRForward:5′-GCACAAGCAAACGGAAGACC-3′Reverse: 5′-GACCTTGGTTCTCACACCTGGT-3′TIPE2Forward:5′-GTCGGTTCGGTAGCGCTGCT-3′Reverse:5′-TATCCTGGAACGTACGTATG-3′sPD-1Forward:5′-GGGTGACAGAGAGAAGGGCAGA-3′Reverse:5′-TGGCTCCTATTGTCCCTCGTGC-3′GAPDHForward:5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTC-3′Reverse:5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′

Clinical characteristicsnRelative expressiontPGender Male570.81±0.290.742>0.05 Female360.85±0.18Age >60 years old450.86±0.271.401>0.05 ≤60 years old480.79±0.21Phase Active phase540.98±0.296.281<0.05 Release phase390.65±0.18

Clinical characteristicsnRelative expressiontPGender Male570.21±0.081.342>0.05 Female360.19±0.05Age >60 years old450.19±0.121.427>0.05 ≤60 years old480.22±0.08Phase Active phase540.13±0.0315.018<0.05 Release phase390.29±0.07

2.3RA不同特征关节腔积液中TIPE2 mRNA相对表达量比较 见表4。不同性别和年龄关节腔积液中TIPE2 mRNA相对表达量比较无统计学差异(P>0.05)；急性活动期关节腔积液中TIPE2 mRNA相对表达量低于缓解期，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4RA不同特征关节腔积液中sPD-1 mRNA相对表达量比较 见表5。不同性别和年龄关节腔积液中sPD-1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；急性活动期关节腔积液中sPD-1 mRNA相对表达量高于缓解期，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

目前，RA的具体发病原因尚未完全阐明，普遍认为是由过度活化的T淋巴细胞介导的一种自身免疫性疾病[8，9]。且相关研究报道表明，RA患者体内多种协同刺激分子失衡，则会促进疾病的发生[10]。淋巴毒素(LT)是最早发现的一种细胞因子，主要是淋巴细胞受有丝分裂原或者抗原等刺激活化后及在某些自身免疫疾病和肿瘤情况下分泌的细胞因子[11]。LT与肿瘤坏死因子-α是密切相关的两个细胞因子，同时转移因子家族。LT与肿瘤坏死因子-α有许多相似的生物学功能，如诱导多种分化细胞的抗原表达、炎症反应的应答、免疫反应的调节以及多种肿瘤细胞的杀伤作用[12]。LTβR是转移因子受体超家族成员之一，是调节器官和组织内环境稳态的一种重要中间介质。LTβR能够激活NF-κB途径，促进炎症的反应。LTβR在免疫系统中发挥信号传递功能，若其调节异常则会导致自身炎症和免疫性疾病，包括自身免疫性胰腺炎、类风湿性关节炎等[13]。本文研究结果显示，研究组关节腔积液中LTβR mRNA相对表达量高于对照组，急性活动期关节腔积液中LTβR mRNA相对表达量高于缓解期，提示RA患者sPD-1 mRNA表达明显上升，且急性活动期其表达上升越高。sPD-1是1992年发现CD28超家族中一员，主要由2号染色体上PDCD1基因变化，其在T细胞杂交瘤细胞死亡过程中表达上调[14]。 sPD-1在感染、肿瘤、自身免疫病等疾病中发挥重要作用。有研究显示，RA患者滑膜液中PD-1+T细胞和PD-L1+T单核细胞数量增加，并且其在RA的滑膜炎病程中发挥重要作用[15]。此外，有研究显示，RA患者急性活动期sPD-1显著高于缓解期，可能sPD-1对RA活动期发挥了更重要的作用[16]。本研究结果显示，研究组关节腔积液中sPD-1 mRNA相对表达量高于对照组，急性活动期关节腔积液中sPD-1 mRNA相对表达量高于缓解期，提示RA患者sPD-1 mRNA表达明显上升，且急性活动期其表达上升更高，与上述文献报道基本一致。TIPE2在维持机体免疫稳态中具有重要调节作用，主要表达于淋巴结、脾脏、胸腺等免疫应答组织中[17]。实验研究报道表明，TIPE2基因敲除小鼠会发生IL-1、IL-12和肿瘤坏死因子-α等炎症因子表达升高及发生多器官自发性炎症[18]。本研究结果显示，研究组关节腔积液中TIPE2 mRNA相对表达量低于对照组，急性活动期关节腔积液中TIPE2 mRNA相对表达量低于缓解期，提示RA患者sPD-1 mRNA表达降低，且急性活动期表达下降更加明显。

Clinical characteristicsnRelative expressiontPGender Male570.19±0.091.177>0.05 Female360.17±0.06Age >60 years old450.20±0.081.928>0.05 ≤60 years old480.17±0.07Phase Active phase540.24±0.099.727<0.05 Release phase390.09±0.04

综上所述，LTβR和sPD-1高表达及TIPE2低表达参与RA病情发生、发展，在RA诊断中具有一定的价值，值得临床借鉴。