HIV-1感染过程中外周血CD8+CD127+T细胞活化耗竭研究①

刘 显 董 原 彭丽珊 杨 洋 王登嵘 伍月榕 郁晓磊 于 丽④ 王 盈 肖 健④

(广西中医药大学第一附属医院，南宁 530001)

HIV-1属于慢病毒属，即使有相应的体液免疫和细胞免疫应答，其仍然可在宿主体内持续存在，且存在较长的潜伏期。HIV-1的感染对象为表达CD4的多种细胞类型，主要为CD4+T细胞。HIV-1的复制和病毒血症首先被强有力的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)应答所抑制。部分接触HIV-1的T细胞前体分化成为可被低浓度抗原激活、细胞因子、协同刺激分子所激活的记忆性T细胞。记忆T细胞高表达CD127，可介导与增强再次免疫应答。

CD127是长期记忆性细胞的标志，CD8+CD127+T细胞可在无抗原刺激情况下生存[1,2]。CD127作为IL-7的α链受体其表达与T细胞增殖、分化和存活密切相关[3]，IL-7/IL7R介导的信号通路参与T细胞的稳态[4-6]，促进与胸腺T细胞发育和外周T细胞增殖[7]。持续刺激IL-7信号可诱导初始CD8+T细胞增殖和促进干扰素IFN-γ的产生[8]。相反，中断IL-7信号则维持体内CD8+T细胞平衡以促进体内细胞存活。在病毒感染性疾病过程中，CD8+T细胞CD127表达降低[9]。在HIV感染过程中，CD127表达的下调与HIV特异性CD8+T细胞的细胞毒性功能缺陷相关[10]，也与抗病毒治疗后免疫重建的失败有关[2]。此外，IL-7已被证明是慢性病毒感染和癌症中的重要治疗性细胞因子[11]。

因此，探索外周血CD8+CD127+T细胞免疫状态对揭示抗HIV-1感染机制具有重要意义。目前，从免疫活化与耗竭的角度探索HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T细胞与病程的相关性研究较少。本研究以CD8+CD127+T 细胞作为研究对象，选取并测定活化指标CD38、HLA-DR，耗竭指标PD-1的表达水平，从活化与耗竭的角度来分析探讨外周血CD8+CD127+T细胞在HIV-1感染过程中的状态变化，以探索机体调控抗HIV-1感染的细胞免疫机制。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1实验材料、试剂 PB-anti-CD3、PerCP-anti-CD4、PE-Cy7-anti-CD38、ECD-anti-HLA-DR、APC-anti-PD-1流式抗体购自BD公司，FACSAriaⅡ流式细胞仪购自BD公司、高速离心机购自Eppendorf公司、Ficoll人淋巴细胞分离液购自GE公司、PBS、RPMI1640、胎牛血清购自四季清公司。

1.1.2临床资料 根据中国卫生行业艾滋病感染诊断标准(WS 293-2008)在2012年10月至2014年10月期间收集上海市疾病预防控制中心以及山西运城市疾病预防控制中心就诊的未经抗病毒治疗HIV-1感染者59例，本研究设3个实验组，1个阴性对照组。实验组根据CD4计数值分为典型进展者(Typical progressors,TPs)29例，慢性感染者(Chronic HIV-1 infected persons,CPs)13例,HIV携带者(HIV Carrys，CRs)17例。

1.1.3纳入标准 TPs指感染至纳入研究时间不超过10年、CD4+T细胞计数<350个/μl、未接受抗病毒治疗者；CPs指CD4+T细胞计数≥350个/μl，<500个/μl、未接受抗病毒治疗者；CRs,指CD4+T细胞计数≥500个/μl、感染不超过10年的未接受抗病毒治疗者。阴性对照组为健康捐赠者(Healthy donors,HDs)，共16例。所有被研究者排除HBV、HCV合并感染的可能。两组间一般资料对比无明显差异，本实验经患者知情同意并取得医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1外周血采集和单个核细胞分离 用EDTA抗凝管采集HIV-1感染者和健康志愿者外周静脉血2 ml，静置30 min后与PBS 1∶1混匀，以密度梯度分离法常规分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)。根据采样计数结果用含2%胎牛血清的RPMI1640调整为1×107个/ml的细胞悬液。

1.2.2流式细胞术检测CD8+T细胞PD-1、CD38、HLA-DR的表达水平 每个样本取100 μl PBMCs悬液，加入适量荧光素标记的抗人单克隆抗体：CD3-PB、CD4-PerCP、CD127-PE、CD38-PE-Cy7、HLA-DR-PE-TR、PD-1-APC，4℃避光孵育30 min；PBS清洗后，4℃避光孵育30 min；PBS液清洗后经1%多聚甲醛溶液固定。用流式细胞仪检测。本研究以CD3+CD4-T细胞群作为CD8+T细胞，以荧光扣除对照作为设门依据，分析CD8+CD127+T细胞PD-1、CD38、HLA-DR的表达情况。

2 结果

2.1HIV-1感染者外周血CD8+T 细胞CD127表达降低 TPs组、CPs组、CRs组、HDs组CD8+T细胞CD127表达频率分别为(22.51±8.530)%、(30.33±10.50)%、(38.62±11.94)%、(39.78±10.73)%。TPs组CD8+T细胞CD127表达低于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)；CPs组CD8+T细胞CD127表达低于HDs组患，差异有统计学意义(P<0.05)；CPs组和CPs组之间、CRs组和HDs组之间CD8+T细胞CD127表达无统计学差异(均P>0.05),见图1。

图1 慢性HIV-1感染过程中CD8+T细胞CD127的表达Fig.1 Expression of CD127 on CD8+T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.*.P<0.05;***.P<0.001.

2.2HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T细胞上CD38的表达增高 TPs组、CPs组、CRs组、HDs组CD8+CD127+T细胞CD38的表达比例分别为(41.35±11.52)%、(28.84±14.62)%、(29.13±10.51)%、(27.21±7.607)%。TPs组CD8+CD127+T细胞CD38表达高于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)；CPs、CRs和HDs三组间CD8+CD127+T细胞CD38表达差异无统计学意义(均P<0.05)，见图2。

2.3HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T细胞上HLA-DR的表达增高 TPs组、CPs组、CRs组、HDs组CD8+CD127+T细胞HLA-DR的表达比例分别为(26.01±12.10)%、(25.39±12.40)%、(17.68±10.31)%、(12.59±9.637)%。HDs组CD8+CD127+T细胞HLA-DR表达低于其他三组，差异有统计学意义(P<0.05)，CPs组CD8+CD127+T细胞HLA-DR表达高于CRs组和HDs组，差异有统计学意义(P<0.05)；TPs、CPs和CRs三组间CD8+CD127+T细胞HLA-DR表达无统计学差异(P>0.05)，见图3。

图2 慢性HIV-1感染过程中CD8+CD127+ T细胞上CD38的表达Fig.2 Expression of CD38 on CD8+CD127+ T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.**.P<0.01;***.P<0.001.

图3 慢性HIV-1感染过程中CD8+CD127+T细胞上HLA-DR的表达Fig.3 Expression of HLA-DR on CD8+CD127+ T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.*.P<0.05;**.P<0.01.

2.4HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T细胞上PD-1的表达增高 TPs组、CPs组、CRs组、HDs组CD8+CD127+T细胞PD-1的表达比例分别为(13.420±7.194)%、(14.310±7.848)%、(7.303±4.951)%、(5.700±2.532)%。TPs组CD8+CD127+T细胞PD-1表达高于CRs和HDs组，差异有统计学意义(P<0.05)，CPs组CD8+CD127+T细胞PD-1表达高于CRs组和HDs组，差异有统计学意义(P<0.05)；CRs组与HDs组CD8+CD127+T细胞PD-1表达无统计学差异(P>0.05)，见图4。

2.5HIV-1感染者外周血CD4计数与CD8+T细胞上CD127、CD8+CD127+T细胞上PD-1、CD38、HLA-DR表达的相关性 相关性分析表明，HIV-1感染者CD4计数与CD8+T细胞CD127表达正相关(r=0.569 6，P<0.000 1)，CD8+CD127+T细胞上CD38、HLA-DR、PD-1的表达频率与CD4计数存在负相关关系(r=-0.418 3，P=0.001 0；r=-0.261 6，P=0.045 4；r=-0.314 2，P=0.015 4)，见图5。

2.6HIV-1感染者外周血CD8+CD127+T细胞PD-1表达与CD38、HLA-DR的相关性 相关性分析表明，HIV-1感染者CD8+CD127+T细胞HLA-DR的表达频率与PD-1的表达存在正相关关系(r=0.642 7，P<0.000 1)；HIV-1感染者CD8+CD127+T细胞CD38的表达频率与PD-1的表达无相关性(r=0.038 97，P=0.770 0)，见图6。

图4 慢性HIV-1感染过程中CD8+CD127+ T细胞上PD-1的表达Fig.4 Expression of PD-1 on CD8+CD127+ T cells during chronic HIV-1 infectionNote: A.Flow picture;B.Statistics graph.**.P<0.01;***.P<0.001.

图5 慢性HIV-1感染过程中CD4计数与CD8+T细胞CD127百分比、CD8+CD127+T细胞上CD38、HLA-DR、PD-1表达的相关性Fig.5 Correlation of CD127 expression on CD8+T cells,CD38,HLA-DR and PD-1 expression on CD8+CD127+T cells with CD4 counts during chronic HIV-1 infection

图6 HIV-1感染者CD8+CD127+T细胞CD38、HLA-DR的表达与PD-1的相关性Fig.6 Correlation between CD38 and HLA-DR with PD-1 in CD8+CD127+T during HIV-1 infection

3 讨论

抗原特异性CD8+T细胞的识别功能与杀伤作用是抗HIV-1感染的关键，表达IL-7受体的α链(IL-7Rα，又称为CD127)是识别记忆性CD8+T细胞的标志[1]。CD127的表达降低与诸多慢性病毒感染、癌症的不良预后有关，CD127表达降低影响IL-7的活性，导致CTL的杀伤作用降低[12]。HIV-1感染者经抗逆转录病毒治疗后，CD4+CD45RO+T细胞CD127表达恢复程度与CD4计数正相关[13-15]。实验结果显示，未治疗的HIV-1感染者CD8+T细胞CD127的百分比显著低于健康捐赠者。

CD4细胞计数是衡量HIV-1疾病进展的主要标志，即使抗病毒治疗也不能使患者CD4计数恢复到正常水平[15]。比较感染者的CD8+CD127+细胞与CD4+T细胞水平的相关关系，结果显示HIV-1感染者CD4计数与CD8+T细胞CD127表达正相关。这说明CD8+CD127+细胞可能有助于维持CD4+T 细胞的水平，在抗HIV-1感染过程中发挥着重要作用。由病毒引起的免疫激活可诱导幼稚T细胞向记忆T细胞转化[17]，但是随着HIV-1病程的进展CD8+CD127+T细胞却逐渐减少，这种消耗CD8+CD127+T细胞的机制还不清楚，可能与免疫激活引起的耗竭有关。

为了验证上述假设，我们检测了CD8+CD127+T细胞上的活化分子CD38、HLA-DR和凋亡分子PD-1的表达。PD-1因在T细胞杂交瘤细胞上调介导细胞程序性死亡而命名，其配体为PD-L1和PD-L2。HIV Tat蛋白可诱导巨噬细胞和树突状细胞上PD-L1和PD-L2高表达，致使CD8+T细胞分泌细胞因子能力下降，增殖受损而引起持续性的感染[18-20]。CD38和HLA-DR均表达于活化的T细胞表面，被认为是T细胞活化的标志[21,22]。差异性分析显示，HIV-1感染者外周血中CD8+CD127+T细胞上PD-1、CD38、HLA-DR的表达均明显高于健康对照组。且相关性分析显示，CD8+CD127+T细胞上CD38、HLA-DR、PD-1的表达频率与CD4计数存在负相关关系。该结果提示，HIV-1感染者CD8+CD127+T细胞处于异常的高度活化、凋亡的状态。通过进一步分析CD38、HLA-DR、PD-1三者之间的关系发现，HIV-1感染者CD8+CD127+T细胞PD-1的表达与HLA-DR的表达频率正相关，与CD38的表达频率无相关性。提示HIV-1感染过程中，随着CD8+CD127+T细胞的大量的活化，PD-1可能诱导性表达于CD8+CD127+T细胞表面，从而使其功能趋于耗竭，这可能是HIV-1逃避免疫杀伤的一种重要机制。我们的前期研究表明[23]，HIV感染后CD8+T细胞整体呈现出高活化耗竭状态，并不局限于CD8+CD127+T细胞。CD8+T细胞上PD-1的过度表达与HIV感染过程中CD8+T细胞的免疫耗竭、功能抑制相关，通过体外阻断PD-1/PD-L1通路可恢复CD8+T细胞分泌TNF-α、IFN-γ的能力。但值得注意的是，PD-1在HIV-1感染者CD8+T细胞上的表达与HLA-DR、CD38均存在正相关关系，而在CD8+CD127+T细胞上与CD38的表达并不存在相关性。该差异提示：在CD8+T细胞的不同亚群中可能存在耗竭机制的差异。在后续的研究中，我们将比较CD8+CD127+T与CD8+CD127-T这两群细胞中活化和耗竭的情况，并设计体外实验，阻断PD-1/PD-L1通路观察上述分子的表达变化，以得出进一步的结论。

综上所述，我们的研究表明HIV-1感染过程中CD8+CD127+T细胞高活化耗竭可能是CD8+T细胞上CD127表达下降的原因。但是，与CD8+CD127+T细胞状态相关的除CD38、HLA-DR、PD-1外，还涉及 CTLA4、CD160等众多膜表面分子的相互作用、细胞与细胞间相互识别等其他因素。本次研究仅初步揭示了CD8+CD127+T细胞在HIV-1感染中耗竭的部分免疫机制，后续我们将从信号通路的角度研究PD-1表达对CD8+CD127+T细胞的影响，为HIV-1感染的免疫机制提供更多的实验依据和理论基础。