淫羊藿苷脂质体经鼻给药对帕金森病大鼠行为学及神经递质的影响

程志清 黄建平 朱文宗 支英豪 赵应征

[摘要] 目的 观察经鼻给予淫羊藿苷脂质体对帕金森病模型大鼠的行为学症状及纹状体相关神经递质含量的影响。 方法 按随机原则选16只大鼠为假手术组（假手术/in组），另将64只造模成功的PD大鼠分为PD模型组（PD/in组）、淫羊藿苷脂质体经鼻给药组（ICA-PGL/in组）、淫羊藿苷经鼻给药组（ICA/in组）、淫羊藿苷脂质体静脉注射给药组（ICA-PGL/iv组），每组16只。药物持续干预2周后，通过检测大鼠阿扑吗啡旋转次数、圆筒实验、纹状体区TH表达以及相关神经递质含量的改变来观察淫羊藿苷脂质体结合经鼻给药方式对帕金森病模型大鼠的疗效。 结果 淫羊藿苷各治疗组运动功能较PD/in组有不同程度的改善，纹状体区双侧TH阳性纤维表达及纹状体区右侧单胺类神经递质DA、DOPAC和HVA含量较PD/in组均有不同程度的提高，其中以ICA-PGL/in组疗效最为突出（P<0.01）。 结论 经鼻给药淫羊藿苷脂质体对帕金森病模型大鼠运动功能及神经递质的修复有不错的疗效。

[关键词] 淫羊藿苷脂质体;帕金森病模型;经鼻给药;行为学;神经递质

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）19-0043-05

[Abstract] Objective To observe the effects of nasal administration of icariin liposome on behavioral symptoms and striatum-associated neurotransmitter levels in Parkinson's disease model rats. Methods Sixteen rats were randomly selected as sham operation group（sham operation/in group）， and 64 successful modeling PD rats were divided into PD model group（PD/in group） and icariin liposome intranasal administration group（ICA-PGL/in group）， icariin intranasal administration group（ICA/in group）， and icariin liposome intravenous administration group（ICA-PGL/iv group）， 16 rats in each group. After two weeks of continuous drug intervention， the efficacy of icariin liposome combined with nasal administration on Parkinson's disease model rats was observed by numbers of apomorphine rotation， cylinder test， TH expression in striatum and changes of related neurotransmitters. Results The results showed that the motor function of each icariin treatment group was improved to some extent when compared with the PD/in group. The expression of bilateral TH-positive fibers in the striatum and the levels of monoamine neurotransmitter DA， DOPAC and HVA on the right side of the striatum were increased in different degrees when compared with PD/in group， and the effect in ICA-PGL/in group was the most significant（P<0.01）. Conclusion The intranasal administration of icariin liposomes has a good effect on the motor function and neurotransmitter repair in Parkinson's disease model rats.

[Key words] Icariin liposome; Parkinson's disease model; Intranasal administration; Behavior; Neurotransmitter

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一種神经退行性疾病，常发生于中老年人。PD在中医学中虽然没有相对应、独立的中医病名，但根据各家中医描述，属于中医学中的“颤证”范畴，同时全国中医学会老年医学会在1991年脑病学术研讨会上制定的《中医老年颤证诊断和疗效评定标准》里将PD的中医病名确定为“颤证”[1]。传统中医认为本病的基本病机为肾精亏虚，髓海失充，最终导致筋脉失濡、肢体失控。“肾主骨生髓”，同时“脑为髓之海”，因此可以通过服用滋肾益筋药物，达到补益脑髓及改善颤证的疗效。滋肾药物中的代表药物淫羊藿的主要活性成分淫羊藿苷具有较好的补肾强筋、改善脑功能等作用[2]。稳定的淫羊藿苷脂质，结合经鼻给药方式，可以避免口服给药方式产生的药物首过效应，同时绕过血脑屏障，弥补传统给药方式入脑有效量少的缺点，促使药物以更高的生物利用度进入脑组织，发挥药效，而且前期实验发现其对鼻黏膜有较好的安全性[4]。本实验通过制备淫羊藿苷脂质体[3，4]结合经鼻给药方式观察其对PD大鼠的疗效。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物  选用由上海斯莱克公司提供的SD清洁级雄性大鼠，体重约280～320 g，大鼠饲养于温州医科大学实验动物中心，自然光照，自由进食及饮水，室温维持在25℃。许可证号：SCXK（沪）2003-0003。

1.1.2 实验药物  实验室已具备成熟制备脂质体技术，制备并得到平均粒径250 nm淫羊藿苷脂质体[4]。根据前期实验结果[4]，将各药物组均配置成含淫羊藿苷0.30 mg/mL浓度的淫羊藿苷脂质体溶液或淫羊藿苷溶液。

1.1.3 主要药品与试剂  淫羊藿苷（克洛玛生物科技有限公司）;氢化蛋黄磷脂、吐温80及胆固醇等脂质体相关制备材料（温州医科大学药学院）;6-羟基多巴（6-OHDA）、酪氨酸羟化酶抗体（TH）、阿朴吗啡（APO）、戊巴比妥钠及HE试剂等（Sigma-Aldrich公司）。

1.1.4主要仪器  大鼠脑立体定向仪SR-6N9（日本Narishige公司）、低温离心机5415R（Germany公司）、自动匀浆机HFJ-8（北京华尔博科技有限责任公司）、20 μL微量注射器（上海精密仪器公司提供）、高效液相色谱仪Agilent 1100（美国Agilent）、光学显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制备  将大鼠麻醉后（戊巴比妥钠溶液50 mg/kg），固定于脑立体定位仪（SR-6N9）上，将头顶前囟部皮肤备皮、消毒，在中线位置切开一1.5 cm的切口。6-OHDA注射位点参考《大鼠脑立体定向图谱》[5]，两注射位点的位置分别为：前囟前0.7 mm，中线右3 mm，硬膜下4.5 mm以及前囟后0.2 mm，中线右2.6 mm，硬膜下 6.0 mm[6]。以2 μg/（μL·min）速度在每定位点各注射5 μL的6-OHDA（2 μg/μL浓度溶于0.2%的抗坏血酸生理盐水中），注射完毕留置7 min后，以1 mm/min速度缓慢将注射针退出，缝合皮肤。假手术组仅注射含0.2%抗坏血酸的等体积生理盐水，其余步骤均同上。

1.2.2 检验模型  造模4周后，腹腔注射 APO（0.5 mg/kg），计数30 min内各组大鼠向健侧旋转次数，如超过7次/min，则视PD大鼠模型造模成功。

1.2.3 分组及干预  随机取16只SD大鼠作为假手术/in组，另将64只造模成功大鼠随机分为四组，每组16只：PD/in组、ICA-PGL/in组、ICA/in组，ICA-PGL/iv组。假手术/in组和PD/in组予0.9%的生理盐水经鼻给药，后三组分别予淫羊藿苷脂质体经鼻、淫羊藿溶液经鼻及淫羊藿苷脂质体静脉注射给药干预（给药组每组淫羊藿苷浓度均为0.30 mg/mL）。所有实验组均为100 μL等体积给药。

1.2.4 给药方法  鼻腔给药：戊巴比妥钠溶液30 mg/kg腹腔注射大鼠致轻度麻醉，仰卧位固定，大鼠鼻腔气道与平台维持趋于水平位置。每次取5 μL溶液（定量移液管吸取）缓慢滴入大鼠一侧鼻孔，2 min后对另一侧鼻孔给药（相同方法），每隔2 min交换鼻孔，缓慢给药避免大鼠呛咳，每次给药时间为40 min[7，8]。尾静脉给药：以浓度75%乙醇轻擦大鼠尾静脉处，缓慢静脉推注淫羊藿苷脂质体溶液，给药完毕后常规无菌止血。

1.2.5 标本采集  各组大鼠随机取8只相应处理结束24 h后，常规处死，冰冷生理盐水心脏灌流致全身僵硬，断头及剥离完整大脑，固定于多聚甲醛（4%浓度）24 h以上。清水冲洗脑组织，取黑质区、纹状体区各切3 mm，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。剩余各组大鼠麻醉处死，迅速断头、剥离脑组织，在冰面上快速分离出纹状体，保存于-80℃ 冰箱备用。

1.3 观察指标

1.3.1 APO诱导转圈  造模4周及给药2周后，腹腔注射 APO（0.5 mg/kg），计数30 min内各组大鼠向健侧旋转次数。

1.3.2 圆筒实验  圆筒试验主要用于评估前肢活动的协调功能。在PD大鼠造模前1周及治疗2周后，各组随机选8只大鼠，置于透明的有机玻璃圆筒（20×30 cm）中，将镜子置于圆筒后以完全观察大鼠;记录前肢与筒壁的接触次数3 min。计算左前肢接触与筒壁的比率的公式取自Karhunen H等[9]及Wei Chen等[10]。左前肢碰壁比率=（a+c×0.5）/（a+b+d）。其中a：左前肢接触筒壁的次数，b：一只前肢保持接触筒壁，然后另一只前肢接触筒壁次数及双上肢同时接触筒壁的次数;c：双上肢同时接触筒壁的次数;d：右前肢接触筒壁的次数。

1.3.3 免疫组织化学染色法  免疫组化染片前，常规烤箱烤片30 min，二甲苯脱蜡以及水化。免疫组化步骤，按相关试剂盒说明书进行标准操作。

1.3.4 纹状体区相关神经递质检测  a.高效液相电化学（HPLC-ECD）检测：色谱柱采用C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为水相（每1升中含辛烷磺酸钠0.16 g，乙二胺四乙酸钠10 mg，二水磷酸钠15.60 g，氯化钾 3.75 g，pH值4.9）与甲醇的体积比为13：87，流速为1.0 mL/min，柱温25℃，电化学检测器工作电极为玻璃碳电极，参比电极为银/氯化银（Ag/AgCl）电极，工作电压為0.55 V，进样量均为20 μL，电导率为1055，检测单胺类神经递质（DA、DOPAC和HVA）。b.制作标准曲线：分别称取单胺类神经递质（DA、DOPAC和HVA）5 mg置于50 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/mL HClO4定容，配置成0.1 mg/mL的标准品母液，再用0.1 mol/mL HClO4稀释至5000 ng/mL、1000 ng/mL、500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL，进行高效液相电化学（HPLC-ECD）检测。最后分别以相应神经递质的浓度对峰面积值制作标准曲线。c.处理：每毫克组织加高氯酸（现配0.1 mol/mL HClO4）10 μL，匀浆，12000 r/min、4℃条件下离心10 min，取上清液，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取虑液进行检测。

1.4 统计学方法

本研究以SPSS 23.0统计软件进行分析。两组之间计量资料比较用t检验，多组间样本比较用one-way ANOVA方法，两两比较采用SNK方法，P<0.01为有显著性差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠旋转实验比较

给药2周后，各组大鼠腹腔注射APO，假手术/in组未见APO诱发的转圈行为，ICA-PGL/in组[（5.58±1.0）次/min，P<0.01]、ICA/in组[（6.21±1.19）次/min，P<0.01]、ICA-PGL/iv组[（6.50±1.34）次/min，P<0.05]较PD/in组[（7.79±0.72）次/min]均有不同程度减少，其中以ICA-PGL/in组改善效果最为显著。

2.2 各组大鼠圆筒实验比较

造模前，各组大鼠的左前肢碰壁次数及左前肢碰壁比率均无统计学差异。给药2周后，假手术/in组的左前肢碰壁次数较造模前稍有下降，但无统计学差异（P>0.05），左前肢碰壁比率未见明显变化，其他各组PD模型大鼠的左前肢碰壁次数及比率均较造模前显著下降。同时与PD/in组比较，淫羊藿苷各治疗组的左前肢碰壁次数及比率有不同程度的改善，以ICA-PGL/in组效果最为显著（P<0.01）。见表2。

2.3各实验组大鼠黑质区HE染色比较

如封三图5示，假手术/in组大鼠双侧黑质区及各实验组健侧（左侧）黑质区的神经元细胞形态正常，结构清晰，分布密集;PD/in组大鼠受损侧可见神经细胞数目明显减少，部分胞体变小。与PD/in组受损侧比较，淫羊藿苷各治疗组受损侧黑质区的神经元细胞数量不同程度增多，细胞结构较清晰，但有少数神经元变性。

2.4 各实验组纹状体部位 TH 阳性神经纤维比较

如封三图6示，假手术/in组大鼠纹状体区未见多巴胺能神经元细胞分布，但可见多巴胺能神经元纤维密集分布。其余各组大鼠损毁侧纹状体TH 表达（P<0.01）和健侧纹状体TH 表达较假手术/in组均有不同程度降低。ICA-PGL /in组双侧（P<0.01）、ICA/in组受损侧（P<0.01）、健侧（P<0.05）TH表达较PD/in组对应侧提高最为明显，ICA-PGL/iv组双侧亦有改善趋势（P>0.05）。同时治疗组间有统计学差异，ICA-PGL/in组TH阳性表达最高（P<0.01）。见表3。

2.5 各实验组大鼠右侧纹状体的单胺类神经递质含量

ICA-PGL/in组右侧纹状体中3种单胺类神经递质的含量较PD/in组有明显的提高（P<0.01），优于ICA/in组（P<0.01）和ICA-PGL/iv组（P>0.05）。结果表明柔性纳米脂质体技术结合经鼻给药方式可以增强淫羊藿苷对PD大鼠单胺类神经递质的影响。见表4。

3 讨论

传统给药方式治疗神经系统疾病，药物需经过肝脏首过效应及胃肠道酶的降解作用和血脑屏障，最终到达颅内的剂量极少。为达到有效治疗量，需增加药物剂量，势必带来更大的药物副作用和不良反应。而通过脑实质内或鞘内等途径给药治疗中枢神经系统疾病，具有侵入性伤害和感染风险[11]。目前鼻腔给药是一种无创、非侵入式的新兴方法，可以绕过血脑屏障并将药物靶向治疗中枢神经系统疾病[12-14]。鼻腔通过嗅神经、三叉神经分支、面神经分支可与中枢神经系统直接联系，经鼻给药可绕过血脑屏障，直接通过鼻腔通路到达中枢神经细胞，有效增加颅内药物浓度[15，16]。但单纯鼻腔给药也存在较大问题，包括药物很难长时间滞留于鼻腔，同时容易被鼻纤毛等清除[17]，另外鼻黏膜对外来的物质刺激十分敏感。因此本实验制备了脂质体包载的淫羊藿苷，其中脂质体中磷脂双分子层，可以有效实现控缓释放药物，起到平稳血药浓度的作用，同时，保护药物在吸收以及转运过程中不被酶分解，达到增加药物疗效的作用[18]。前期实验亦表明其对鼻黏膜无明显的毒副作用，有较好的安全性。

鼻腔药物的吸收与药物分子的大小、親油、亲水平衡及酶在鼻腔的降解等[19]有关。通常鼻腔给药随药物分子量增高，鼻腔吸收量逐渐降低，而小于1 000 的化合物经鼻腔给药后，生物利用度较高。另外小分子药物或粒径300 nm以内的粒子可以通过鼻腔嗅部的嗅黏膜吸收，透过筛板经嗅球入脑[3，20]。而本研究中淫羊藿苷分子量676.65，其脂质体平均粒径达258 nm，保证了淫羊藿苷脂质体经鼻入脑的可行性。

前期实验已表明淫羊藿苷脂质体经鼻给药可以有效入脑，同时研究发现空白脂质体对PD大鼠无治疗作用，故本研究将不再设置空白脂质体组。

本研究圆筒实验中，生理盐水干预2周后，假手术/in组的左前肢碰壁次数较造模前有所下降（P>0.05），但左前肢碰壁比率未见明显变化，同时假手术/in组未见APO诱发的转圈行为，考虑假手术/in组的左前肢的碰壁次数下降和大鼠适应圆筒环境导致碰壁次数下降有关。免疫组化实验中，PD/in双侧纹状体TH阳性表达较假手术/in组均有降低，可见单侧（右侧）注射6-OHDA制备大鼠模型，对对侧（左侧）纹状体区TH神经纤维表达亦有影响。上述实验结果提示淫羊藿苷不同剂型、不同给药方式均能改善大鼠的肢体协调功能及提高纹状体区多巴胺能神经元纤维表达，其中以淫羊藿苷脂质体经鼻给药方式作用更为显著。

单胺类神经递质的检测结果提示各治疗组大鼠损毁纹状体区单胺类神经递质及其产物含量较PD/in增加，其中ICA-PGL/in组显著促进了DA的释放，增加了纹状体DA及代谢产物的含量，补充纹状体DA的不足，增强运动功能，从而改善PD模型大鼠的运动功能。

本研究提示淫羊藿苷脂质体结合经鼻给药方式可能通过保护黑质区神经元，提高纹状体区多巴胺能神经元纤维的表达和单胺类神经递质含量，进一步改善PD大鼠运动功能。

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（收稿日期：2018-09-25）