优化ATP荧光法检测医院次氯酸钠消毒后物体表面菌落数的稳定性观察

张博，刘阳，樊海鑫，陈玉，赵小梨，张丽娟，陆红玲

作者单位：遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义 563000

ATP荧光法快速检测细菌总数是一种以生物发光反应为基础的检测方法，该方法检测菌落总数便捷、快速、准确，通过该方法能实时监测操作流程和生产环境中微生物含量，可以从源头避免因细菌总数超标导致的严重后果，因此近些年在多个相关的行业领域中都得到了广泛的应用，尤其是对卫生环境要求严格的部门，如医院和食品企业等等。

目前我国大多数医院普遍都是采用消毒液来进行杀菌消毒的，此法成本低，使用范围广，目前消毒的效果还是根据国家标准（GB15982-2012）来进行菌落总数的培养，此法培养时间长，一般需要48～72 h，但是经过长时间的菌落培养等待，被消毒的位置可能菌落总数早已经超标，此时使用ATP荧光法就是对消毒效果是否理想很好的补充检查。但是外界因素很容易影响荧光法的稳定性，造成结果的不准确，这种结果的不稳定使该方法的应用范围受到了很大的限制［1-6］。

本研究自2018年3—11月在ATP荧光反应试剂中加入不同保护成分来增强试剂稳定性，以次氯酸钠（化学分子式为NaClO）消毒物表做为实验对象，筛选一种可以明显降低干扰次氯酸钠消毒液检测结果的试剂，目的是提高ATP荧光法检测结果的稳定性，提高其在医疗领域的应用范围。

1 材料与方法

1.1试剂及仪器本研究中所用的磷酸二氢钠，次氯酸钠等生化试剂均为国产分析纯，购自广东华大技术有限公司；蛋白纯化系统为美国GE公司生产的液相色谱系统AKTA PURIFIER；检测荧光信号仪器为北京滨松光子技术有限公司生产的BHP9505微量光度仪。

1.2试剂制备

1.2.1PBS缓冲液的配制 pH7.8的0.2 mol/L NaH2PO48.5 mL与0.2 mol/L Na2HPO491.5 mL混合。

1.2.2ATP荧光反应试剂的制备 荧光素酶0.02mg/mL；D-荧光素0.003 mg/mL；pH7.8的Tris-HCl 50 mmol/L；KCl100 mmol/L；MgCl22 mmol/L；丙三醇（glyercol）10%；聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）1%。溶液配制后用一次性灭菌的0.2–m水系滤膜过滤除菌。

1.2.3消毒试剂的配制 将次氯酸钠配制成5%的母液备用，使用时将母液现用灭菌蒸馏水1∶100进行稀释。

1.3反应机制基于萤火虫生物发光的原理，在有镁离子存在的条件下，萤火虫荧光素酶以D-荧光素、ATP、O2为底物，将化学能转化为光能并释放光量子［4］，其发光强度（I）与ATP浓度（cATP）符合函数关系；I＝Imax×cATP/Km+cATP，式中，Imax为最大发光强度；Km为l×l0-4。可知，当cATP远小于Km时，I正比于样品中的cATP。因此可通过测定发光体系的I值来定量ATP浓度［7］。正常条件下细菌体内的ATP含量趋近恒定，为10-18mol［8］。以光电倍增管为核心采光部件的光度计都能检测低于10 pg分子的ATP，这就使快速、准确检测细菌成为可能［9］。

1.4蛋白纯化萤火虫荧光素酶质粒由美国Cellex公司CEO James惠赠，该质粒载体为pET15b-sumo。将该质粒转化到BL21DE3感受态细胞中，经过培养挑取单克隆接菌到LB培养基中，37℃培养4 h后18℃异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，得到的粗纯蛋白质经过Ni+离子交换纯化后，获得较高纯度的萤火虫荧光素酶。

1.5ATP荧光试剂的成分优化ATP荧光法在实际检测应用的过程中非常容易受到外界因素的干扰，比如次氯酸钠会影响检测结果的最低灵敏度和稳定性，而次氯酸钠溶液也经常被用在物体表面消毒的过程中。为此我们首先对荧光试剂的成分进行优化，在原试剂成分中加入终浓度2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和2%硫酸铵来增加荧光反应试剂中的蛋白质浓度和提高试剂的稳定性。

1.6次氯酸钠消毒后菌落总数的检测方法选取一块1.2 m×2 m的大理石平台，用0.05%NaClO溶液将无菌卫生棉浸湿，擦拭平台表面，20 min晾干。在72 h内分别9次采用平皿法和优化前后两种ATP荧光试剂同时检测所得到样品中的细菌总数。

1.7采样方法将无菌棉签用灭菌的PBS缓冲液浸湿，将棉签在所要检测的物体表面均匀涂擦，进行细菌采集，采样面积为10 cm×10 cm，将取样后的棉签头部剪掉手接触部分再次放入装有1mLPBS灭菌的EP管中涡旋摇晃洗涤数次，即得到物体表面菌样。将得到的菌样进行菌落总数（CFU）和相对发光值（RLU）检测，以CFU和RLU值做结果分析。

1.8统计学方法采用SPSS 19.0进行分析，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1次氯酸钠消毒后荧光法检测与菌落总数相关性经消毒剂擦拭晾干后，平皿法检测的结果是没有任何细菌，但采用优化前ATP荧光试剂检测结果却显示出一定的光值，在随后的72 h，平皿法检测结果随着时间的增加，细菌总数随之增加，但荧光法检测在24 h内的检测结果没有规律，24 h后随着时间的变化，荧光值（RLU）与细菌总数（CFU）有一定的相关性（图1，2）。因此，当被检样品细菌数较少时，检测结果受次氯酸钠的影响较大，但随着次氯酸钠的不断降解和细菌总数的增加，次氯酸钠对荧光法检测结果的影响逐渐变小。优化后的荧光试剂检测的结果则与平皿法检测的结果有一定的相关性（图3）。

图1 次氯酸钠消毒后的物表72 h菌落总数变化曲线

图2 次氯酸钠消毒后的物表72 h荧光值变化曲线

图3 优化后的荧光试剂检测次氯酸钠消毒后的物表72 h荧光值曲线

2.2次氯酸钠消毒后荧光法菌落总数标准曲线的建立我们再次通过对医院50张办公桌和50位工作人员的手共100个样品采用次氯酸钠溶液进行消毒，经过5 h后，采用国标平皿法和ATP荧光法两种方法同时进行检测，将平皿法检测菌落总数（CFU）和荧光法检测荧光值（RLU）的两组数据进行线性拟合，建立标准曲线（图4），得出公式（1）：y＝0.062 7x+12.453（R2＝0.962 5），说明在次氯酸钠消毒后的的物体表面经过一段时间后其菌落生物发光值与菌落总数存在着线性相关关系。

图4 ATP荧光法检测次氯酸钠消毒后表面的菌落总数标准曲线

2.3次氯酸钠消毒后荧光法与菌落总数的检测我们再次用相同的方法选取医院30处不同洁净程度的物体表面（用次氯酸钠溶液消毒）。把荧光法检测得到的RLU值带入公式（1），推算出CFU值（菌落总数预测值），再将平皿法测得的CFU值（菌落总数实际值）和菌落总数预测值（表1），用SPSS软件进行显著性和相关性分析，结果表明当经过次氯酸钠溶液擦拭过的物表再次采用荧光法检测时，平皿法检测出的实际CFU值与荧光法推测的CFU预测值在P＜0.01水平上呈显著相关，相关系数r＝0.985。即优化后的ATP荧光试剂在检测次氯酸钠溶液擦拭后的物体表面的结果与国标平皿计数法基本一致，可以用此方法对次氯酸钠消毒后的物体表面清洁度进行半定量的判断。

表1 30处不同洁净程度的物体表面次氯酸钠消毒后的菌落总数预测值与实际推算值

医院消毒标准-国标（GB15982-2012）规定1 cm2的面积CFU≤5.0，本实验的采样面积为10 cm×10 cm，所以检测标准设定为500 CFU，我们根据荧光法推导出的CFU结果与平皿法检测的结果进行比对，并参考国标（GB15982-2012），发现当RLU值低于7 000时，无论荧光法计算出的菌落总数CFU和平皿法实测的菌落总数CFU结果均小于450，当RLU高于8 000时，对应CFU的结果均高于550，所以我们将光值RLU低于7 000设定为清洁；RLU高于8 000设定为污染；RLU光值7 000～8 000设定为警告，需要进一步检测（表2）。

表2 医院消毒半定量标准

根据表2的判断标准，我们随机在医院检测了次氯酸钠消毒后的护理托盘、医护人员的双手、办公桌面。由两个人分别各自采用一种方法进行双盲实验进行验证。结果显示当平皿法检测结果细菌超标时，荧光法测得的RLU值按照表2中设定的结果同样为超标。当平皿法检测的结果为合格时，荧光法测得的光值同样低于设定污染的光值。验证试验共检测15个样品，其中平皿法测得12个为合格样品，不合格样品3个。荧光法测得11个为合格样品，3个为不合格样品，1个为警告（表3）。该结果表明该方法改进后可以对经过次氯酸钠消毒液擦拭后的物体表面细菌总数的多少作出半定量的判断。

表3 两种方法15组盲测结果对比

3 讨论

目前国标法细菌总数测定采用的是平皿法，工作量大，等待时间长，所以大大降低了工作效率，而且对于营养富集的检测样品不能做到实时监测，过长的检测时间会造成细菌的大量增长，如果通过荧光法对样品进行半定量的测定，快速的给出样品合格、警告、不合格的参考，则可以快速提高工作效率和避免因检测结果时间过长造成细菌超标的危害［8，10］。

ATP荧光法的酶促反应对外界干扰较为敏感，而目前市场中常用的消毒液种类繁多，每一种消毒液对反应的光值均有不同程度的影响，所以限制了该方法在医院中的应用。我们通过调研多家三甲医院，发现所使用的消毒液主要成分为次氯酸钠，所以我们将其作为首选并对检测试剂进行了优化，克服了在低灵敏度时次氯酸钠消毒液对检测结果的影响，并初步建立了检测标准。不同的医院或部门可以根据环境卫生的要求单独对检测标准细化，如清洁、基本清洁、警告、污染、重度污染等。另该方法的检测结果RLU光值能直接由仪器读出，并对检测结果进行不同等级的划分，直接为使用部门提供半定量的检测结果，避免了检测前需要建立标准曲线等一系列复杂的换算过程，既为日常的检测节约了时间，又便于检测人员的使用。本实验选取了较为常见的次氯酸钠消毒样品来进行实验，为荧光试剂在医院领域大范围的应用提供参考，但该试剂优化后仍然对市场上其他大部分消毒液种类不具备普遍性，因此我们也在不断的进行后续的实验，力争早日研发出更为稳定、适应性更广泛的荧光快速检测试剂。