壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶抗菌止血作用的研究

历雪，王思颖，丁雪，张冬娇，何秀霞

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

全球每年因为细菌和病毒感染致死的人数约占全球死亡率的三分之一。感染方式有吸入带病菌的空气、伤口接触带病菌的物体、食用带病菌的食物等。细菌感染导致的常见病有破伤风、肺炎、伤寒等，一些细菌甚至能够引起癌症［1］。抗菌材料指具有杀灭或抑制细菌功能的新型功能材料。目前抗菌材料更多的指通过添加抗菌物质，从而使材料具有抑制或杀灭表面细菌能力的新型功能材料，如抗菌塑料、抗菌纤维和抗菌金属材料等［2］。

无机金属抗菌材料耐热性好、抗菌范围广、抗菌力强、持久性好、毒性低、无味且无耐药性。Bin Zhang等人［3］选用银离子为抗菌离子，硝酸丙二酸酯作为添加剂，制备出抗菌材料。结果表明，这种新型无机抗菌材料具有良好的热稳定性和光稳定性。但无机材料制造工艺复杂困难，且有限制性，如铜系抗菌剂颜色较深，银系抗菌剂易氧化变色且价格昂贵，锌及其他金属抗菌效果则相对较差。有机抗菌材料来源广泛、技术成熟方便、杀菌效果好、范围广、颜色稳定性好、价格低。闫思思［4］分析了小分子季铵盐和高分子季铵盐的抗菌特点、原理、性能及小分子季铵盐构效关系等，进一步推进季铵盐的研究与发展。Delaviz Yasaman等人［5］通过共价将环丙沙星（CF）结合到交联的二价寡聚物的主干上从而实现了抗菌功能。但是有机低分子抗菌剂存在毒性、安全性差、不耐热、化学稳定性较差、易水解、易使微生物产生耐药性、寿命短等缺点。天然抗菌材料广谱抗菌、天然环保、无毒无害、生物相容性好、来源广泛。María Angélica Gómez等人［6］分析了甲壳类/软骨素类硫酸酯类凝胶悬浮质凝胶的抗菌活性，发现象蒜萃取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有活性，揭示了天然提取物的治疗潜力。其缺点是不耐热，产量受企业的生产规模和工艺条件限制，药效普遍较短。

为此研制出互补的复合型抗菌材料显得尤为重要。J.Kratochvíl等人［7］发现用适当定制数量的 Cu NPs和C：F形成的纳米复合材料对大肠杆菌提供强烈的抗菌作用而对细胞没有任何伤害。Michael Arkas，G等人［8］采用两种仿生反应得到二氧化硅/超支化聚（乙烯亚胺）（PEI）/银纳米颗粒，发现它们对大肠杆菌、铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌的抗菌活性优良。Xiaoli Liu等人［9］共同制备了良好的生物相容性、无细胞毒性和低溶血性的壳聚糖寡糖-N-氯磺酸曼尼希碱（COS-N-MB）的新型无毒抗菌材料。

1 实验方法

1.1 迷迭香提取物的制备

将100g迷迭香研磨清洗后用400mL的80%的乙醇溶液浸泡24h，要求水面淹没迷迭香表面。之后将浸泡液分装进50mL离心管超声破碎30min，将滤液在60℃条件下蒸发，浓缩至100mL。将超声后的提取液在4℃、12000r/min的条件下离心10min，取上清液。用滤器过滤除菌，得到100mL乙醇中含有100g迷迭香提取物，即得到100mL的1g/mL的迷迭香醇提物。

应用二倍稀释法对以上得到的迷迭香醇提物进行稀释，得到100mL的0.5g/mL迷迭香醇提物和100mL的约0.125g/mL的迷迭香醇提物，将三种浓度的醇提物密封在4℃的冰箱保存待用［15］。

1.2 制胶

低分子量壳聚糖（LMW壳聚糖）和高分子量壳聚糖（HMW壳聚糖）与不同浓度迷迭香混合，冷冻干燥法，得到壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶的样品与迷迭香的干粉［16］。

1.3 表征

1.3.1 扫描电镜及傅里叶红外光谱表征

将以上制备成功的壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶表面喷金后，用扫描电镜观察，并且拍下电镜照片；并且应用傅里叶红外光谱测量多孔干凝胶和迷迭香干粉的红外光谱。

1.3.2 孔率检测

取制备出来的8份多孔干凝胶样品，称取质量m0；取烧杯加满无水乙醇，称质量m1；把干凝胶样品分别加入吸饱水分，去除多余的乙醇，称质量m2；移除吸饱水分的样品，称质量m3。按照公式（1）计算（ρe表示无水乙醇的密度），得出各个样品的孔率，并且以孔率为纵轴干凝胶种类为横轴做柱形图。

㊳ 插 图 出 自 L.D.Ettlinger,“The Pictorial Source of Ripa's'Historia'”,Journal of the Warburg and Courtauld Institutes,vol.13,no.3/4,1950,图版 63。

1.3.3 吸水率检测

分别取8份干凝胶样品，分别称取质量m0；把其分别浸入乙醇溶液中0.5h，取出，用滤纸除去样品表面溶液，称取样品质量m1；按照公式（2）计算得出吸水率，以吸水率为纵轴种类为横轴做折线图。

1.3.4 降解率检测

取这8种干凝胶各9份，每份20mg左右，每份计质量m0；样品浸入10mL PBS溶液中，置入恒温振荡箱，37℃，30r/min持续振荡；每天随机取8种干胶各3份样品进行蒸馏水漂洗冻干，称质量mt，持续三天。按照公式（3）计算降解率，以时间为横轴、降解率为纵轴得到折线图。

1.3.5 体外药物释放测试

测定迷迭香的最大吸收峰λ，并以λ为波长进行不同浓度迷迭香溶液（X）的吸光光度（Y）的测定，绘制迷迭香浓度-吸光光度标准曲线，得到其线性方程记录待用。而后做释放测试，即取干凝胶干燥式样M0（约10mg）；分别置入25mL的PBS（PH=7.4）溶液中，封紧烧杯，于37℃恒温震荡箱30r/min持续震荡，每隔一定时间（0-72小时内每12或24小时）取5mL释放液，在上述得到的波长λ下测量其吸光光度值A，并向其中补充相同体积和温度的PBS溶液；把得到的吸光光度值A带入迷迭香浓度-吸光光度标准曲线方程得到相应的浓度C（此浓度就是干凝胶里的迷迭香成分释放出来的浓度）；用浓度C和已知的释放液体积5mL得出迷迭香的释放质量M1。由公式（4）可计算累积释放量，以时间为横轴累计释放量为纵轴做折线图［17］。

1.4 抑菌试验

制作滤纸片成直径6mm，在121℃条件下干热灭菌20min，冷却备用。将滤纸片分别浸泡在1g/mL、0.5g/mL、0.125g/mL的迷迭香浓度迷迭香醇提物里，使其充分润湿，将含有迷迭香提取物的滤纸片晾干后用烧灼灭菌的镊子分别贴于含菌培养基表面，相互间要间隔一定距离，使滤纸片与培养基表面密贴；将制备好的含0.125g/mL、1g/mL迷迭香浓度的干凝胶和纯壳聚糖干凝胶制备成直径为6mm的圆型样品，分别浸入0.1mol/L的PBS溶液中，后在紫外线下消毒30min；取第一步制成的菌悬液1mL均匀涂布在固体培养基平板表面，用无菌镊子将各样品分别贴在含菌平板上，每个平板贴四个，标记好种类；于37℃下培养24h，之后取出测定抑菌圈直径并记录以及得到抑菌圈的照片［18］。

1.5 体外凝血实验

采取人血液加入抗凝血剂柠檬酸钠（血∶抗凝血剂体积比为9∶1）制成血液样本逐滴加入1cm2的正方形样品表面，恒温振荡10min，缓慢加入50mL去离子水，37℃恒温以100r/振荡5min；取上步的溶液用紫外分光光度计在415nm波长下测量吸光光度值A（将0.1mL血用去离子水稀释为50mL后的吸光光度值作为A0），按照公式计算凝血指数［19］。

1.6 生物相容性

取96孔板，各孔加入100μL的细胞悬液；细胞贴壁后加入材料培养24h后，每孔加入10μL的5g/L的MTT溶液，37℃下培养4h；把培育好的细胞吸弃上清液，向样品中加入75μL二甲基亚砜，震荡10min，使结晶物充分溶解；用酶联免疫检测仪在490nm波长下测量吸光光度值A。得到以种类为横轴、吸光度值为纵轴的柱形图［20-21］。

2 结果与分析

2.1 干凝胶成品扫描电镜

扫描电镜的结果图1（a）与图1（b）表明纯壳聚糖多孔干凝胶与掺加了迷迭香醇提物的壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶的孔径都较大，结构较为完整。

图1 扫描电镜照片

2.2 傅里叶红外光谱

图2的红外光谱1500cm-1处是芳香环的骨架震动吸收峰，显示出壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶中存在芳香环结构，壳聚糖与迷迭香醇提物混合成功。

图2 傅里叶红外光谱0、0.5、1代表迷迭香浓度，单位g/mL

2.3 孔率

图3表明，高分子量的壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶孔率在61.75%到83.19%之间，低分子量的孔率在75.06%到79.67%之间，大的孔率有利于在伤口处大量吸附血液形成血块从而止血。

图3 孔率的柱形图其中h代表HMW，l代表LMW，0、0.125、0.5、1代表迷迭香浓度，单位g/mL

2.4 吸水率

图4（a）LMW的壳聚糖多孔干凝胶最大吸水率在迷迭香浓度0.5g/mL左右，图4（b）HMW的的最大吸水率在迷迭香浓度为0.125g/mL左右。大的吸水率意味着可以大量的吸收水，当与伤口接触的时候可以使伤口保持湿润的状态，更好的发挥止血的作用，从而加速伤口的封闭和愈合。

图4 壳聚糖多孔干凝胶的吸水率0、0.125、0.5、1代表迷迭香浓度，单位g/mL

2.5 降解率

图5（a）为LMW多孔干凝胶的降解效率图，随着时间的延长LMW多孔干凝胶72h的降解率为41.67%到71.07%，图5（b）为HMW多孔干凝胶的降解效率图，随着时间的延长HMW多孔干凝胶72h的降解率为31.85%到84.35%，这意味着其可以很快的被吸收或者代谢出体外。

图5 壳聚糖多孔干凝胶的降解率0、0.125、0.5、1代表迷迭香浓度，单位g/mL

2.6 体外药物释放率

y=5.0638x+0.1784（R2=0.9846）为标准曲线计算得公式，图6（a）LMW壳聚糖多孔干凝胶和图6（b）HMW多孔干凝胶的体外药物释放率都在24h到48h之间达到百分百的释放，保证了药物对患处的医治效果。

图6 壳聚糖多孔干凝胶释放率0.125、0.5、1代表迷迭香浓度，单位g/mL

2.7 抑菌实验

图7 壳聚糖多孔干凝胶抑菌效果图图中0、1、2、3分别表示0g/mL、0.125g/mL、0.5g/mL、1g/mL迷迭香浓度

表1 LMW多孔干凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈

表2 HMW多孔干凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈

图7（a）为LMW的壳聚糖多孔干凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈，图7（b）为HMW的壳聚糖多孔干凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈，表1为LMW的壳聚糖多孔干凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径、表2为HMW的壳聚糖多孔干凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，可以从中看出该样品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常显著。掺杂了迷迭香的多孔干凝胶抑菌效果随着迷迭香的浓度的增大而增大，LMW与HMW的壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶的抑菌效果差异不大。利用相同方式检测分析出其对沙门氏菌、大肠杆菌也具有明显的抑菌效果，同时也符合迷迭香浓度越大而抑菌效果越好的特点。样品对于实验用的三种菌的抑制效果为对金黄色葡萄球菌的抑制效果＞对沙门氏菌的抑制效果＞对大肠杆菌的抑制效果。

2.8 体外凝血实验

图8（a）LMW的凝血效果会稍微的劣于图8（b）HMW的壳聚糖多孔干凝胶，掺加了迷迭香之后的凝血效果最佳都是在其浓度为0.5g/mL左右。

图8 壳聚糖多孔干凝胶的凝血指数0、0.125、0.5、1代表迷迭香浓度单位g/mL

2.9 MTT测细胞活性实验

图9可以看出加入了材料的细胞的活性有增加的趋势，壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶对细胞无伤害作用，低分子量和高分子量壳聚糖的区别并不明显，随着的迷迭香浓度增加多孔干凝胶对细胞的培养效果更好。

图9 MTT 24h的实验结果

3 结论

通过扫描电镜可以看出壳聚糖多孔干凝胶具有较大的孔径，傅里叶红外光谱显示出迷迭香成分与壳聚糖成分充分混合了。

壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶具有很大的孔率，其中高分子量的壳聚糖多孔干凝胶孔率高于低分子量的壳聚糖多孔干凝胶。壳聚糖多孔干凝胶具有自身效果5到10倍的吸水效果，其中低分子量掺杂了迷迭香醇提物的最好吸水率在迷迭香浓度为0.5g/mL左右，高分子量掺杂了迷迭香醇提物的最好的吸水率在迷迭香浓度为0.125g/mL左右的时候。壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶还具有很好降解率，随着时间的增加不断增强，在72h的时候已经可以降解到80%左右。同时其具有很好药物释放率，低分子量壳聚糖多孔干凝胶和高分子量多孔干凝胶的体外药物释放率都在24h到48h之间达到百分之百。

单纯的壳聚糖多孔干凝胶对各种菌株的抑菌效果并不明显，混杂了迷迭香醇提物的的样品对金黄色破萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等却具有较为明显的抑菌效果，抑菌的效果随着迷迭香浓度的增加而变好，其中其对金黄色葡萄球菌抑菌效果最为突出，低分子量壳聚糖与高分子量壳聚糖的抑菌效果差异不大。

当迷迭香浓度为0.5g/mL的时候凝血效果最好，其中高分子量的凝血效果更好一些。

壳聚糖/迷迭香多孔干凝胶对细胞无伤害作用，低分子量和高分子量壳聚糖的区别并不明显，随着的迷迭香浓度增加多孔干凝胶对细胞的培养效果更好。

综合以上所有实验数据确定高分子量壳聚糖+0.5g/mL迷迭香为实验筛选得到的良好的抑菌兼凝血材料。