绞股蓝总皂苷对ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠血管PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信号通路的影响

葛樯樯，王雪芬，宗 磊，卜劲松，卢德赵

(1.上虞人民医院，浙江 上虞 312300；2.浙江中医药大学生命科学学院，浙江 杭州 310053)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础，是引起心肌梗死、外周动脉疾病的主要原因。有研究表明，脂质的代谢失衡在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键作用[1]。由过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、肝 X受体α(liver X receptor α，LXR-α)、三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)组成的通路是胆固醇逆转运的重要通路[2]。绞股蓝总皂苷(gypenosides，Gps)是绞股蓝最主要的生物活性成分，具有降血脂、防治动脉粥样硬的作用[3]。但其机制尚未明确。本研究采用高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠的方法建立AS模型，研究绞股蓝总皂苷对PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信号通路的作用，以探讨绞股蓝总皂苷防治AS的分子机制。

1 材料

1.1 动物

20只ApoE-/-小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2011-0003。实验动物饲养于浙江中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证：SYXK(浙)2013-0184。

1.2 主要试剂

绞股蓝总皂苷购自大连美仑生物技术有限公司(UV≥98%)，批号：J0423AS；PPARγ、LXR-α、ABCA1一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，批号：22061-1-AP，14351-1-AP，25782-1-AP；逆转录试剂盒、羊抗鼠IgG 、羊抗兔IgG、RIPA裂解液、Trizon、eEcl化学发光显影液、BCA试剂盒均购自北京康为世纪生物有限公司，批号分别为：30147、10146、10146、1915E、03877/0148、30223、50150。

2 方法

2.1 AS模型的建立及分组

20只ApoE-/-小鼠适应性饲养1周后，随机分为4组，即正常组、AS模型组、绞股蓝总皂苷低剂量组、绞股蓝总皂苷高剂量组，每组各5只。正常组：饲养时进食普通颗粒饲料；AS模型组：进食高脂饲料8周；绞股蓝总皂苷低剂量组：在模型组的基础上同时灌胃给药，绞股蓝总皂苷剂量为200 mg·kg-1，每日1次，连续给药8周；绞股蓝总皂苷高剂量组：在模型组的基础上同时灌胃给药，绞股蓝总皂苷剂量为400 mg·kg-1，每日1次，连续给药8周。

2.2 血脂检测

眼球取血，全自动生化分析仪上检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量。

2.3 病理形态学观察

小鼠麻醉后，在冰上通过解剖获取主动脉弓组织，10%福尔马林溶液中固定。将主动脉弓(厚度约为4μm)的贴壁组织切片用苏木精-伊红(H&E)染色，检测染色动脉粥样硬化斑块面积，并在尼康Ti-S 倒置显微镜的20×放大倍数下观察异常结构。通过IMAGEPRO PLUS软件测定病变面积(μm2)。

2.4 荧光定量PCR检测PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的表达

取主动脉组织，按Trizol 试剂盒说明书提取各组总RNA，并按逆转录试剂盒说明将RNA逆转录成cDNA，取逆转录产物进行PCR扩增。引物序列如表1所示。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。反应结束后进行数据分析。

2.5 免疫印迹法检测PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白的表达

取各组主动脉血管，液氮研磨后加入 0.5 mL RIPA裂解液，而后置于冰上超声破碎，4℃ 12000 rpm离心10 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转法转膜，脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗孵育2h，洗膜，化学显影，分析各条带灰度值。

2.6 统计学处理

采用SPSS19.0 软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 绞股蓝总皂苷对血脂的影响

ApoE-/-小鼠高脂饲料饲养8周后，与正常组相比，模型组TC、TG、LDL-C、HDL-C显著升高(P<0.05)；与模型组相比，400 mg·kg-1绞股蓝总皂苷处理后，TC、TG、LDL-C显著下降(P<0.05)，并呈一定的剂量依赖性关系，而HDL-C无明显的变化。见表1。

表1 AS小鼠血清中TC、FC、LDL-C、HDL-C的含量

注：LSD进行组间比较，其中：*与正常组比较，P<0.05；▲与模型组比较，P<0.05

3.2 绞股蓝总皂苷对小鼠血管斑块形成的影响

正常组小鼠的血管内壁也有斑块形成。而与正常组相比，模型组小鼠血管内壁明显增厚，可观察到明显的斑块。用不同浓度的绞股蓝总皂苷干预后，血管内壁增厚的情况有所改善。说明绞股蓝总皂苷能抑制血管的脂质累积，从而抑制血管内壁增生的形成，进而发挥抗AS的作用。

3.3 绞股蓝总皂苷对小鼠主动脉PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的的影响

定量PCR法检测了各组小鼠主动脉PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的表达情况，结果显示，与正常组相比，模型组PPAR-γ、LXR-α、ABCA1 mRNA的表达升高(P<0.05)，绞股蓝总皂苷干预后，能显著增加PPAR-γ、LXR-α、ABCA1的表达(P<0.05)，并呈现浓度依赖性。见表2。

表2 绞股蓝总皂苷对小鼠主动脉PPAR-γ、LXR-α、ABCA1mRNA的影响

注：LSD进行组间比较，其中：*与正常组比较，P<0.05；▲与模型组比较，P<0.05

3.4 绞股蓝总皂苷对小鼠血管PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白表达的影响

应用免疫印迹技术检测小鼠主动脉PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白表达的情况。结果表明，与模型组相比，400 mg·kg-1绞股蓝总皂苷干预后，PPAR-γ、LXR-α、ABCA1表达量显著增加(P<0.05)。见表3。以上结果与荧光定量PCR结果一致。说明绞股蓝总皂苷可能通过激活PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信号通路，促进胆固醇的外排，从而发挥抗AS的作用。

表3 绞股蓝总皂苷对小鼠主动脉PPAR-γ、LXR-α、ABCA1蛋白表达的比较

注：LSD进行组间比较，其中：*与正常组比较，P<0.05；▲与模型组比较，P<0.05

4 讨论

AS是心脑血管疾病的主要原因和病理基础，而AS的发病机制复杂，其发生发展与脂质累积、炎症反应、内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖等紧密相关[4]。本研究发现，与正常组相比，模型组ApoE-/-小鼠经8周高脂饲养后，血清中TC、TG和LDL-C的水平显著升高，动脉粥样硬化斑块明显增大。而用绞股蓝总皂苷处理后，TC、TG和LDL-C水平明显降低，主动脉中AS斑块显著变小，说明绞股蓝总皂苷具有明显的降血脂和抗AS的作用。

现有研究表明，上调ABCA1的表达，能显著降低THP-1源性泡沫细胞脂质的累积，减少泡沫细胞的形成[5]。本研究发现，与对照组小鼠比较，AS模型小鼠中ABCA1表达也上调，主要原因为高脂状态下，动物脂质摄入过多，会应激性地增加脂质的代谢与外排。绞股蓝总皂苷能够在蛋白水平及基因水平上促进ABCA1的表达，促进胆固醇的流出，减少泡沫细胞的形成，抑制AS的进程。

ABCA1的表达受多种因素的调控，而PPAR-γ/LXR-α通路是调节 ABCA1表达的核心机制。肝脏X受体作为核转录因子，能够调控ABCA1及ABCG1的转录,进而调节胆固醇的转运[7]。我们也在研究中发现，与模型组比较，200mg·kg-1和400mg·kg-1绞股蓝总皂苷灌胃处理AS小鼠后，能够促进PPAR-γ、LXR-α的表达。

综上所述，绞股蓝总皂苷能降低ApoE-/-AS模型小鼠血清中TC、FC、LDL-C的含量；激活PPAR-γ/LXR-α/ABCA1信号通路，促进胆固醇外流，减少泡沫细胞的形成，进而抑制动脉粥样硬化的发展。