中药联合益生菌ZY的毒理学安全性评价

葛冰洁， 桑 锐， 于逸凡， 邹 娟， 王 政， 张雪梅*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2. 长春市动物疫病预防控制中心，吉林 长春 130061)

药物毒理学安全性评价是在了解药物使用过程中对生理功能产生的不良影响的基础上，从确保药物的最大效益、对生态环境和人类健康最小危害性角度出发，全面权衡利弊和实际应用的可能性，对药物的合理生产和安全使用做出评价[1-3]，利用急性毒性和亚急性毒性试验等确定药物的一般毒性[4-5]，利用致突变和致畸试验等确定药物的遗传毒性[6]。

现代药理学表明，传统中药具有安全性高、副作用少、对胃肠道无损伤、对肝肾刺激小等优点[7-10]，益生菌则具有调节肠道微生物平衡、增强免疫力等功能[11-12]，但很多中药由于自身结构而不能被机体直接利用，需经过肠道菌群处理后，才能发挥药效[13]。研究证实中药益生菌配伍制剂集成了中草药和益生素的双重优点，具有毒副作用少、无残留和不易产生耐药性等优势[14-18]。研制的中药益生菌ZY由几味中药黄芪、蒲公英等的主要成分与益生菌枯草杆菌等科学组方而成，经药效学和临床试验证明对动物细菌性腹泻具有良好的防治作用。此研究通过小鼠急性毒性、亚急性毒性、小鼠骨髓红细胞微核和精子畸形试验对中药益生菌ZY进行毒理学安全性评价，为其临床应用与开发提供可靠的安全依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

清洁级昆明系小鼠160只，体重(20±2) g,雌性小鼠55只，雄性小鼠105只，购自延边大学实验动物中心。

1.1.2 药品

中药联合益生菌ZY，由延边大学农学院药理实验室自行研制。提取中药黄芪、蒲公英等主要成分，与益生菌枯草杆菌等按最佳配比组方而成；环磷酰胺(批号：H22022673)，购于广东康爱多连锁药店有限公司。

1.1.3 主要仪器

超净工作台(SW-CJ2FD)，上海新苗医疗器械制造有限公司；电子分析天平(AB145S)，上海精科天美科学仪器有限公司；双开门冰箱(BCD-572WD),海尔集团公司；全自动灭菌锅(LDZM-60KC)，上海申安医疗器械厂；自动组织脱水机(A130390)，艾测科技有限公司；生物组织包埋机(KD-BMIII)、自动切片机(KD-3368AM)，均购自金华科迪仪器有限公司；实体显微镜(CX31)，购自 OLYMPUS 公司；显微镜(SMART)，购自重庆奥特光学仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性试验[19-21]

将中药益生菌ZY用蒸馏水配制成1 g/mL药液，按照最大耐受量(MTD)法进行试验，试验前16 h试验动物断食不断水。选择雌雄各10只小鼠适应性喂养3 d后，按照10 g/kg剂量24 h内灌胃4次，2次给药间隔6 h，累计给药剂量为40 g/kg。记录小鼠精神状态、活动情况、皮毛光泽、食欲排泄、死亡等临床症状，连续观察14 d。

1.2.2 亚急性毒性试验[22]

将40只小鼠随机分为空白组和中药益生菌ZY(低、中、高)剂量组，每组10只，雌雄各半，剂量组按照2.5、5、10 g/kg灌服中药益生菌ZY，空白组灌服蒸馏水，每天同一时间给药，连续14 d。观察并记录小鼠的体重及精神状态、饮食情况、被毛光泽度等；14 d后剖检，观察主要脏器颜色、形状、大小等组织病变情况，称重并计算主要脏器指数，H.E染色法制作病理切片，用显微镜进行组织形态学观察。

1.2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验[23,24]

将50小鼠随机分为空白组、中药益生菌ZY(低、中、高)剂量组和阳性组，每组10只，雌雄各半。剂量组按照2.5、5、10 g/kg灌服中药益生菌ZY，空白组灌服蒸馏水，阳性组按照40 mg/kg灌服环磷酰胺，采用30 h给药法给药，即连续2次给药，间隔24 h，末次给药6 h后脱颈处死，分别取两侧股骨制骨髓涂片、Giemsa染色。每张玻片计数2 000个嗜多染红细胞(PCE)，并计数含微核的PCE, 计算微核率。

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率/‰= 含微核的PCE数/PCE总数×1000‰。

1.2.4 小鼠精子畸形试验[25-28]

将50只6～8周龄雄性小鼠随机分为空白组、中药益生菌ZY(低、中、高)剂量组和阳性组，每组10只，剂量组按照2.5、5、10 g/kg灌服中药益生菌ZY，空白组灌服蒸馏水，阳性组按照40 mg/kg灌服环磷酰胺。连续给药5天，于首次给药后第35天采用脱颈法处死小鼠, 取两侧附睾制精子涂片、伊红染色。每只小鼠计数5 000个完整精子, 并计数其中畸形精子数，计算精子畸形率。

小鼠精子畸形率/% = 畸形精子总数/检查精子总数×100%。

1.2.5 统计学分析

试验数据用“平均数±标准差”表示，采用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差统计分析，组间比较采用t检验，P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 最大耐受量测定结果

在最大给药体积和最大药物浓度条件下，14 d内小鼠未出现死亡，且精神状态、活动情况、皮毛光泽、食欲排泄等临床症状均未出现中毒现象。最大耐受量试验结果显示，中药益生菌ZY对小鼠的最大耐受量大于40 g/kg，根据急性毒性分级标准，中药益生菌ZY属于无毒物质。

2.2 亚急性毒性试验测定结果

各组小鼠采食、饮水等行为均正常、精神状态良好，未见中毒反应；剖检肝、肾、心等主要脏器未见外形异常、表面充血、瘀血、肿胀、渗出、粘连等变化。对小鼠体重的影响见表1，对脏器指数的影响见表2，组织病理学切片见图1～3。

表1 中药益生菌ZY对小鼠体重的影响

注：与空白组比较，“#”表示差异显著(P<0.05)，“##”表示差异极显著(P<0.01)，无肩标表示差异不显著(P>0.05),下同。

由表1可知，与空白组相比，低剂量组小鼠体重差异不显著(P>0.05)；中、高剂量组小鼠体重在给药7 d后显著增加(P<0.05)；高剂量组小鼠体重在给药14 d后极显著增加(P<0.01)。结果表明，中药益生菌ZY不会引起小鼠中毒反应，并且能够以剂量依赖性的方式促进小鼠体重的增加。

表2 中药益生菌ZY对小鼠脏器指数的影响

剖检受试小鼠，观察肝、肾、心等主要脏器未见有异常变化。由表2可知，与空白组相比，各剂量组小鼠脏器指数差异不显著(P>0.05)。结果表明，中药益生菌ZY较长时间、较大剂量使用时对小鼠主要脏器无影响，说明中药益生菌ZY安全无毒，无一般毒性。

对小鼠肝脏进行HE染色，显微镜下观察，可见空白组小鼠肝组织结构完整，细胞壁均匀，细胞核清晰，可见清晰的肝小叶和排列整齐的肝索(图1-A)。低、中、高剂量组小鼠肝组织病理切片结构完整，可以清晰地看到肝小叶，肝索呈放射状，均未见肝细胞损伤和炎症反应，未见肝细胞变性和坏死(图1-B,C,D)。结果表明，中药益生菌ZY对小鼠肝组织无损伤作用，说明中药益生菌ZY对小鼠肝组织无毒性作用。

注:A.空白组;B.低剂量组;C.中剂量组;D.高剂量组;下同。

图1 中药益生菌ZY对小鼠肝脏组织病理变化的影响

Fig.1 Effect of Chinese medicine and probiotics ZY on liver histopathology in mice

图2 中药益生菌ZY对小鼠肾脏组织病理变化的影响

对小鼠肾脏进行HE染色，显微镜下观察，可见空白组小鼠肾单位数量、大小和分布未见异常改变，肾小球未见异常改变，肾小管上皮未见肿胀，远曲小管和集合管未见异常(图2-A)。低、中、高剂量组小鼠肾小球大小正常，形状形态规整，肾间质未见炎症浸润，系膜区无可见增生情况(图2-B,C,D)。结果表明，中药益生菌ZY对小鼠肾脏无损伤作用，说明中药益生菌ZY对小鼠肾脏组织无毒性作用。

图3 中药益生菌ZY对小鼠脾脏组织病理变化的影响

对小鼠脾脏进行HE染色，显微镜下观察，可见空白组小鼠脾脏被膜未见异常，脾血窦内的血细胞和巨噬细胞数目正常(图3-A)。低、中、高剂量组小鼠脾脏被膜与空白组无异，脾血窦内的血细胞和巨噬细胞数目未见异常增多或减少，脾小体淋巴细胞未见损伤，未见瘀血或出血(图3-B,C,D)。结果表明，中药益生菌ZY对小鼠脾脏毒损伤作用，说明中药益生菌ZY对小鼠脾脏无毒性作用。

2.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果

中药益生菌ZY小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率结果见表3。

本试验通过计算小鼠骨髓嗜多染红细胞微核出现率，判断化合物的致突变作用，微核率以千分率计。由表3可知，中药益生菌ZY低、中、高剂量组微核率与空白组相比,差异不显著(P>0.05)，与阳性组相比,差异极显著(P<0.01)。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验的阴性结果表明，中药益生菌ZY无诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率增加的作用，说明其无致小鼠体细胞染色体损伤的作用。

表3 中药益生菌ZY对小鼠骨髓红细胞微核率的影响

2.4 小鼠精子畸形试验测定结果

中药益生菌ZY小鼠精子畸形率结果见表4。

观察并计数无勾、胖头、尾折叠等类型的畸形精子数，分别计算各组精子畸形发生率，精子畸形率以百分数计，中药益生菌ZY试验组精子畸形率与空白组相比,差异不显著(P>0.05)，与阳性组相比,差异极显著(P<0.01)。小鼠精子畸形试验的阴性结果表明，中药益生菌ZY无明显诱发小鼠精子畸形率增加的作用，说明其无致小鼠生殖细胞突变作用，无遗传毒性。

表4 中药益生菌ZY对小鼠精子畸形率的影响

3 讨论与结论

毒理学安全性评价是药物过渡到临床使用的主要依据，通过连续反复给药，观察实验动物出现的毒性反应及脏器病理学改变等分析药物的一般毒性和遗传毒性[29]。本试验通过小鼠最大耐受量、亚急性毒性、骨髓红细胞微核及精子畸形试验对中药益生菌ZY进行毒理学安全性评价。

通过测定最大耐受量来反映中药益生菌ZY的毒性情况。在药物最大浓度和小鼠最大给药量的条件下，未导致小鼠死亡，且所有受试小鼠均未出现中毒反应，剖检观察小鼠主要脏器形态结构未发生异常变化，根据急性毒性分级标准，中药益生菌配伍制剂属于无毒性物质。亚急性毒性是介于急性毒性和慢性毒性之间的一种毒性表现，亚急性毒性试验旨在判断动物接触药物时间较长时，对机体引起结构或功能的损害作用。试验动物的体重变化是反映动物机体中毒效应和毒物毒性的最基本指标，脏器指数是小鼠脏器与体重之比，能在一定程度上反应脏器损伤的程度，当脏器肿大时，脏器指数升高，当脏器萎缩时，脏器指数降低，是提供受试化合物靶器官的重要指标[30-32]。中药益生菌ZY各剂量组小鼠均未出现中毒反应，精神状态均正常，高剂量组小鼠体重与空白组相比,差异极显著，剖检肝、肾等主要器官均无明显病变，脏器指数与空白组相比,差异不显著，观察组织病理学切片显示,肝、肾等主要脏器均无损伤。试验结果说明，中药益生菌ZY较长时间、较大剂量使用时对小鼠机体无损伤作用，并且能够以剂量依赖性的方式促进小鼠体重的增加。试验结果进一步表明，中药益生菌ZY安全无毒。

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和精子畸形试验判断药物的致突变性和遗传毒性是药物安全性评价的重要内容。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验是检测外源化学物质对染色体损伤作用的一种遗传毒性试验方法，是评价细胞遗传学损伤、检测染色体异常最简便的方法，常用微核率作为评价致突变作用的指标[33-34]。通过测定小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率判断中药益生菌配伍制剂致小鼠体细胞突变作用，以此评价该药物的体细胞遗传毒性。精子畸形试验常用来检测药物的生殖毒性和对生殖细胞的致突变性，具有操作方便、经济实用等优点。通过小鼠精子畸形率判断中药益生菌ZY对小鼠生殖细胞的致突变作用，以此评价该药物的生殖细胞遗传毒性。本试验结果表明，中药益生菌ZY对小鼠体细胞和生殖细胞未产生致突变作用，即中药益生菌ZY无致突变作用，无遗传毒性。

综上所述，急性毒性、亚急性毒性和遗传毒性试验结果表明，中药益生菌ZY无一般毒性、致突变性和遗传毒性，这为该药物的合理应用和开发提供了科学依据。