基于银纳米粒子－多壁碳纳米管／玻碳电极的电化学法测定牛奶粉中三聚氰胺

马 妍，申 远，王 川，申贵隽＊，陈章武，王皑琳

（1．大连大学环境与化学工程学院，辽宁大连116622；2．大连大学人才建设办公室，辽宁大连116622）

三聚氰胺（Melamine）分子式为C3N6H6或C3N3（NH2）3，化学名称为1，3，5－三嗪－2，4，6－三胺，简称三胺、蜜胺，为一种三嗪类含氮杂环有机化合物［1］。三聚氰胺的含氮量高达66%，也被称为“蛋白精”。为此有不法分子用作食品添加剂以提高乳制品中蛋白质的含量［2］。毒理学研究显示，动物长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，引起膀胱及肾结石，并可进一步引起移行性细胞增生而诱发膀胱癌［3－4］。婴儿奶粉添加三聚氰胺事件导致了国内乳制品行业的诚信危机，引起了世界范围对乳制品添加三聚氰胺的重视。

目前检测三聚氰胺的方法主要有紫外分光光度法［5－6］、高效液相色谱法［7］、气相色谱法［8］、色谱－质谱联用技术［9］、毛细管电泳法［10－11］、金纳米粒子比色探针法［12－13］等。这些方法中不仅需要昂贵的仪器，复杂的操作流程，而且灵敏度和选择性都有待于进一步提高。本研究以此为出发点，制备银纳米－多壁碳纳米管修饰玻碳电极（AgNPs－MWCNTs／GCE），用循环伏安法（CV）在微电解池系统内选择性萃取、测定牛奶粉样品中的三聚氰胺。该方法简单、便捷，适于快速萃取和测定牛奶中的三聚氰胺。可为相关检测行业提供新的萃取与检测方法，也将为有效消除奶制品中的三聚氰胺提供参考。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

CS300型电化学工作站（武汉科思特公司）；三电极体系：玻碳电极（GCE，Φ＝3mm）或修饰玻碳电极为工作电极，饱和Ag／AgCl电极（天津艾达恒晟公司）为参比电极，0．5mm铂丝电极为对电极；普希科P4－036型笔式酸度计（乐清大仓电子公司）；EX－250能量分散衍射装置（20kV，10000X，15mm）（日本，HORIBA）；Su 8010超高分辨率场发射扫描电子显微镜（30kV，分辨率1．3nm）（日本，HITACHI）；LAMADA 35分光光度计（美国，PerkinElmer）。

甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、氨水（分析纯）购于天津市大茂化学试剂厂；三聚氰胺（分析纯）、N，N－二甲基甲酰胺（DMF）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；AgNO3（分析纯，天津市化学试剂二厂）；NaH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液（PBS，自制）；柠檬酸（分析纯，天津博迪化工股份有限公司），柠檬酸钠（分析纯，无锡市民丰试剂厂）；三氯乙酸（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；MWCNTs（纯度＞95%，Φ＝8～15nm，中国科学院成都有机化学研究所）。实验用水均为二次蒸馏的去离子水。

1．2 AgNPs－MWCNTs／GCE的制备

1．2．1 电极活化 将GCE在麂皮上依次用1．0、0．3μm Al2O3粉末抛光后，用水、0．1mol／L H2SO4、无水乙醇和水各超声清洗5min。将清洗后的电极置于5mmol／L的K3［Fe（CN）6］溶液中扫描，直到获得合适的循环伏安曲线。将电极保存在水中备用。

1．2．2 AgNPs－MWCNTs复合物的制备 称取10mg MWCNTs，搅拌分散在15mL的A液中（2mL体积分数为30%甲醇、6．5mL无水乙醇和6．5mL水，超声5min除氧）。称取0．35g AgNO3配成10mL溶液，加入25%的氨水（体积比1∶2）制成B液。然后再将B液在剧烈搅拌条件下逐滴缓慢加到A液中，并保持体系pH在8～9之间，搅拌至反应完全，隔夜沉淀。取下层沉淀离心分离（1 000r／min、10min），水洗涤后再离心两次至中性（1 000r／min、15min，丙酮洗涤，1 200r／min、5min），取离心后的沉淀物微热烘干剩余的少量丙酮，转移至干燥密闭容器中保存，备用。

1．2．3 电极制备 准确称取1mg制备好的AgNPs－MWCNTs复合物于1mL的DMF中，超声35min至完全均匀分散，用移液枪移取15μL分散液滴涂在干燥洁净的GCE表面，红外灯下挥发溶剂烘干。

图1 微萃取系统装置图Fig．1 Microextraction system1．support；2，3．the extraction reaction cavity；4．work electrode；5．reference to electrode；6．platinum electrode；7．feed inlet；8．liquid outlet．

1．3 电极及微萃取系统的制作与安装

微萃取系统结构及安装图如图1所示。该池采用聚甲基丙烯酸甲酯制备而成，上池体和下池体组成一个总高1mm、直径为11．3mm的内圆柱体空腔结构做为萃取反应区，总体积为100μL。采用三电极体系，将各电极安装在对应的位置后，与电化学工作站相连接。

通过K3［Fe（CN）6］探针分子考察了该微萃取系统的性能。如图2所示，随着微萃取系统体积的增大峰电流略有降低。本次实验选用的溶液体积均为300μL。

图2 微萃取系统性能随体积的变化Fig．2 The dependence of performance of the micro－extraction system on extraction volumes（Curve a：the experiment was operated in our micro－system，curve b：the experiment was conducted under normal volume system1：the working curve between micro－extraction system’s volume and peak current；2and 3：exhibits trends of oxidation peak current and reductive peak current change when the volume of the microextraction system changes from 300，600，900，1 100μL（from top to bottom）．experimental condition：5mmol／L K3［Fe（CN）6］，scan rate：100mV／s，potential range：－0．2－0．6V．

2 结果与讨论

2．1 AgNPs－MWCNTs／GCE制备及工作原理

配制浓度为0．1g／L的三聚氰胺标准溶液，开路富集5min后，运用循环伏安法进行扫描。扫描电位为－1．0～＋1．0V，扫描速度为100mV／s。反应机理如图3所示。Ag＋在MWCNTs中被还原成单质Ag负载于碳纳米管中，通过滴涂的方式附着在GCE表面（图3上）。在电极表面发生的氧化还原反应可能是双电子电子转移过程（图3下）。经由三个N原子上均带有一个正电荷中间体的产物后发生电子重排而得到最后的稳定产物。三个C原子上均带有一个正电荷。这可能是Ag＋与三聚氰胺分子之间存在的键合作用产生了催化效果［15］。

图3 AgNPs－MWCNTs／GCE电极的制备流程及其工作原理Fig．3 Diagram of AgNPs－MWCNTs／GCE preparation process and the working mechanism

2．2 AgNPs－MWCNTs性能及其结构的表征

能谱测试结果如图4所示。AgNPs－MWCNTs复合物均在3keV处出现Ag的特征峰，且35g／L AgNO3制备的复合物中的Ag含量明显高于3．5g／L AgNO3制备的复合物的含量，表明成功的在MWCNTs中掺杂了单质Ag，而空MWCNTs在3keV处无Ag的特征峰出现，表明空MWCNTs中不含有Ag元素。

将制得的AgNPs－MWCNTs复合物在石英比色皿中用DMF均匀的分散，在白背景下通过数码反射成像技术成像，见图4内插图。从图中可以清楚地看到闪亮的光斑和亮点，可能是生成的Ag晶体结构对光发生反射所致。

通过扫描电镜（SEM）表征制备的AgNPs－MWCNTs的结构，测试结果如图5所示。MWCNTs（图5a）的SEM图像中我们可以看出 MWCNTs光滑均匀的缠绕在一起，并没有杂进入其他的物质，制备的AgNPs－MWCNTs（图5b、c）的SEM图像中存在大量的亮斑，可见AgNPs部分成功嵌入了MWCNTs的管腔中。且35g／L AgNO3（图5c）制备的复合物亮斑数目远大于3．5g／L AgNO3（图5b）制备的复合物的数目，表明用稍高浓度的AgNO3溶液所制备出的电极效果更好。

图4 MWCNTs及AgNPs－MWCNTs的能谱图和数码反射成像图Fig．4 Energy spectra and digital reflection image of MWCNTs and AgNPs－MWCNTs

图5 MWCNTs（a）、AgNPs－MWCNTs（b、c）的扫描电镜（SEM）图Fig．5 SEM images of MWCNTs（a）and AgNPs－MWCNTs（b，c）

根据能谱表征的峰面积结果分析，得到了在MWCNTs及AgNPs－MWCNTs中Ag元素的质量分数。在制备前MWCNTs中Ag元素含量为0，制备后AgNPs－MWCNTs复合物中Ag的含量变为2．72%，这表明在MWCNTs中已经负载上了Ag。

2．3 电极性能的表征及优化

2．3．1 GCE、MWCNTs／GCE和AgNPs－MWCNTs／GCE性能的比较 考察了不同电极对三聚氰胺的响应情况，结果如图6所示。裸GCE在三聚氰胺溶液中几乎没有响应（曲线c）；当滴涂MWCNTs后由于导电性能提高使峰电流增大（曲线b）。AgNPs－MWCNTs修饰后，在0．5V处出现了明显的氧化峰，在0V与－0．3V处出现了两组还原峰（曲线a）。表明AgNPs－MWCNTs修饰的电极对于三聚氰胺的电化学反应有着一定的催化作用。

2．3．2 MWCNTs滴涂量的优化 MWCNTs能显著增加三聚氰胺的峰电流。实验表明，电极表面的MWCNTs负载量会对峰电流产生影响。开始氧化峰电流随MWCNTs量的增加而逐渐增加，这可能是因为电极表面的活性位点随MWCNTs量的增加而增多。当用量超过15μL时，峰电流反而降低，此时可能是电极表面膜阻碍了三聚氰胺的传质和其与电极之间的电子传递速度。因此，滴涂在GCE表面的AgNPs－MWCNTs混合液的最佳用量为15μL。

2．3．3 富集时间的优化 在微电解池系统中，将三聚氰胺闭路富集到AgNPs－MWCNTs／GCE修饰电极表面。结果表明，峰电流随着富集时间的增加而不断增大，当富集时间为5min时峰电流不再升高，因此将富集时间选择为5min。

2．4 标准曲线的绘制

设置扫描电位区间为－1～＋1V，扫描速度为100mV／s，运用循环伏安法，在已优化的实验条件下扫描不同浓度的三聚氰胺标准溶液。记录峰电流，绘制峰电流随浓度变化的工作曲线。结果如图7所示，三聚氰胺浓度与峰电流分别在1．0×10－4～0．2g／L与0．2～0．8g／L两个范围内呈现出较好的线性相关。其线性方程分别为：I（μA）＝－617．39c（g／L）＋420．65；I（μA）＝－264．64c（g／L）＋352．67，线性相关系数分别为R21＝0．9937，R22＝0．9963。

图6 三聚氰胺在不同电极上的电化学响应Fig．6 Electrochemical response of melamine at different electrodes（a）AgNPs－MWCNTs／GCE；（b）MWCNTs／GCE；（c）bare GCE．0．1g／L melamine solution，scan rate：100mV／s，potential range：－1．0－1．0V．

图7 三聚氰胺在AgNPs－MWCNTs／GCE上的CV曲线（插图为峰电流与三聚氰胺浓度的关系曲线）Fig．7 CV curves of melamine at AgNPs－MWCNTs／GCE（insert is the relationship between peak current and concentration of melamine）1－9：10－4，10－3，10－2，5×10－2，0．1，0．15，0．2，0．4，0．5，0．7，0．8g／L，respectively．scan rate：100mV／s，potential range：－1．0－1．0V．

2．5 三聚氰胺的萃取结果

运用紫外分光光度法对萃取的结果进行表征。设置波长扫描范围为200～700nm，扫描间隔为1nm。萃取前后最大吸光度的改变情况如图8所示，曲线a、b分别为萃取前、后的吸收光谱。对比a、b可见，萃取后的吸光度明显降低。萃取前浓度为0．01g／L，萃取后的浓度经计算为2．79×10－3g／L。

2．6 干扰实验

选取牛奶粉样品中常见的5种氨基酸（缬氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和赖氨酸）进行干扰性试验。结果如图9所示，三聚氰胺在0．25V左右比所测的氨基酸都少一个氧化峰，且在－0．35V附近与氨基酸相比多出一个还原峰。

图8 萃取前（a）和萃取后（b）三聚氰胺的紫外光谱图Fig．8 Ultraviolet spectra of melamine before（a）and after（b）the extraction

图9 三聚氰胺及不同氨基酸的电化学响应Fig．9 Electrochemical response of the melamine and different amino acids（a）melamine；（b）methionine；（c）phenylalanine；（d）lysine；（e）valine；（f）tryptophan．concentration of solutions：1．0×10－4 g／L，scan rate：100mV／s，potential range：－1．0－1．0V．

2．7 样品测定

在实际牛奶粉样品中进行了回收率实验，样品处理参照文献方法［16］。取1g牛奶粉样品，0．1g三氯乙酸和0．1g CaCl2，用pH＝7的0．1mol／L PBS配制成10mL待测溶液。将其高速离心后，取上层清液并用0．1mol／L NaOH溶液调节pH值至7．0。再次离心后取上层清液进行加标回收率测定。结果见表1。

表1 牛奶粉样品中三聚氰胺回收率测定结果Table 1 Recovery test result of melamine in milk samples

3 结论

用电化学方法研究了AgNPs－MWCNTs／GCE修饰电极在微电解池中对三聚氰胺的电化学萃取与测定。可能是由于MWCNTs中负载AgNPs后，三聚氰胺氧化还原反应的场所受限制，使该修饰电极与底物产生了一对一的催化效果，进而提高了对该氧化还原反应的催化效率。实验结果表明，该方法可以应用于三聚氰胺的萃取和测定。