基于DNA条形码研究浙江沿海牡蛎的种类多样性及其分布特征

王航俊，吕宝强，黄 丹，姚炜民

（国家海洋局温州海洋环境监测中心站，浙江 温州325000）

牡蛎属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎总科、牡蛎科，是我国乃至世界产量最大的经济贝类［1］。在我国长达1.8×104km的海岸线上均有牡蛎的分布，作为一种重要的经济贝类，其野生资源的物种丰度、分布及种质遗传特征等生物多样性现状历来都倍受关注［1-6］。由于牡蛎的广栖息性，贝壳易随其生活环境的变化而发生极大的变化，因此仅依靠传统的形态学或解剖学等方法难以完全解决牡蛎的分类问题，我国乃至世界的牡蛎分类迄今仍存在较多的争论［7-10］。

浙江省地处长江口以南、台湾海峡以北的东海之滨，末次冰盛期后黄渤海生物的南向扩张和南海生物的北向扩张在此交汇，导致该海域的海洋生物不仅种类丰富，而且具有极高的多样性水平［11］。前蔡如星等（1991）较为全面记录了浙江沿海软体动物的种类数量，其中包括10种牡蛎［12］。此外其他研究也记录了几种不同的牡蛎［13-15］，目前已有记录的牡蛎不少于13种。然而考虑到形态学等传统分类学手段鉴定的牡蛎种类可能存在较多的主观局限性［8］，本研究通过采集浙江沿海的7个代表性海域的牡蛎，利用DNA条形码技术，对获得的232个牡蛎样品进行线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基I（Cytochrome c Oxidase Subunit I，COI）和核基因28S核糖体RNA（28SrRNA）扩增和测序，并对所得序列信息进行分子鉴定和系统关系分析。确定每个样品所属的属种名，明确浙江沿海牡蛎的种类分布特征及多样性水平。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究鲜活牡蛎采自浙江省从北至南的7个海域，分别为嵊泗（SS）、象山（XS）、头门（TM）、大陈岛（DC）、清江（QJ）、南麂岛（NJ）、霞关（XG）海域，除清江为养殖牡蛎外，其他均为野生牡蛎，采样海域如图1所示。同一海域的野生牡蛎采集选取多条不同生境的潮间带断面，采样不分个体大小。样品采集做好标记后迅速置于-20℃冷藏。

图1 牡蛎样品采集点Fig.1 Localities for oysters sampling

1.2 DNA提取和PCR扩增

从牡蛎闭壳肌中取出肌肉组织约100 mg，充分剪碎，用酚-氯仿法提取基因组DNA，使用分光光度仪进行浓度及纯度检测。通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增获得线粒体COI基因和核基因28S rRNA基因片段。实验中扩增COI基因所用的引物为LCO1491（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）［16］，其 扩 增28S rRNA基因所用引物为D1F（5′-GGGACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3′）和D6R（5′-CCAGCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3′）［17］。PCR反应体系（25 mm3）：2.5 mm3PCR Buffer，模板DNA 25 ng，dNTP 0.2μmol/dm3，引物1μmol/dm3，镁离子浓度2 mmol/dm3，Taq聚合酶1 U，补加双蒸水至25 mm3。PCR反应条件为：95℃预变性4.00 min；95℃变性72 s，52℃退火30 s，72℃延伸78 s；35个循环，最后72℃延伸10.00 min。PCR产物使用试剂盒进行纯化，并委托上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。PCR引物作为测序引物。

1.3 序列分析及相似度比对

测序获得的DNA序列通过Sequencer进行比对和人工校正，对位后将碱基序列输入DnaSP6［18］软件统计单倍型和等位基因。利用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）和生命条形码数据系统（Barcode of Life Database，BOLD）中的BLAST功能对各单倍型序列进行序列检索，基于相似度比对原理进行种类鉴定。

1.4 系统发育树和遗传距离分析

利用本研究中所获得的COI基因单倍型和28SrRNA等位基因以及NCBI中已经录入的牡蛎序列，基于MEGA 6.06［19］中内置的Clustal W程序进行多重比对。比对后，经剪切形成长度相同的核心序列集，分别用于系统发育树和遗传距离分析。系统发育树构建采用非加权配对算术平均法（UPGMA），Kimura 2-parameter model计算模型，Bootstrap重复1 000次；遗传距离使用Kimura 2-parameter model模型进行计算。

1.5 多样性指数分析

牡蛎多样性及其相关指数分别采用以下方法处理分析：

式（1、2）中：H′为Shannon-Wiener多样性指数，s为每站位所包含的总物种数，Pi为第i种的个体数与总个体数之比值，J′为Pielou均匀度指数。

2 结果与讨论

2.1 测序结果

本研究共对232个牡蛎样品进行扩增测序，其中有两个大陈岛牡蛎样品未获得COI基因序列，其余牡蛎样品均获得长度为640 bp的COI基因序列和长度为784 bp的28SrRNA基因序列。COI序列形成97个单倍型（Hap1～Hap97），其中大陈岛采样群体的单倍型数量最多有30种（表1），在所有样品中，单倍型Hap13、Hap1、Hap8、Hap16和Hap79出现频率最高，而有70个单倍型仅在一个样品中出现。232个28S rRNA序列共发现42个等位基因（Hap1～Hap42），南麂岛的等位基因最多有21种（表1），主要等位基因为Hap12、Hap58和Hap6，出现在172个样品中，而有29个等位基因仅在一个样品中出现。

表1 COI基因单倍型和28S rRNA等位基因在各采样群体的数量分布Tab.1 Numerical distribution of COI gene haplotypes and 28SrRNA alleles at each sampling group

2.2 序列相似度比对

COI单倍型和28S rRNA等位基因序列分别经NCBI和BOLD数据库比对，97个COI单倍型中的94个单倍型与8个确定物种相似度高于99%，2个单倍型（Hap83、Hap84）与GenBank号为KU310925、KU310924、KU310922的小蛎属未定种（Saccostrea sp.）序列相似度高于99%，1个单倍型（Hap82）与GenBank号为JQ027290的小蛎属未定种序列相似度高于99%；42个28S rRNA等位基因中2个等位基因与2个确定种的相似度高于99%，另外40个等位基因与3个属的不确定种有较高的相似度。经COI单倍型比对确定的8个种分别为巨牡蛎属（Crassostrea）5种，分别为福建牡蛎（Crassostrea angulata）、近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）、长牡蛎（Crassostrea gigas）、日本巨牡蛎 （Crassostrea nippona）和熊本牡蛎（Crassostrea sikamea）；小蛎属（Saccostrea）2种，分别为多刺牡蛎（Saccostrea echinata）和棘刺牡蛎（Saccostrea kegaki）；牡蛎属（Ostrea）1种，为疏纹牡蛎 （Ostrea circumpicta）；经28SrRNA等位基因比对确定的2个种分别为熊本牡蛎和密鳞牡蛎（Ostrea denselamellosa），40个不确定种的3个属分别为巨牡蛎属、小蛎属和牡蛎属。

2.3 系统发育分析

以新硬牡蛎（Neopycnodnte cochlear）作为外群，分别对97个COI单倍型和42个28SrRNA等位基因构建系统进化树，结果如图2所示。基于COI单倍型的聚类结果除了Hap82与小蛎属的2种聚为一大支，其余单倍型均与确定的物种以97%以上的置信值聚为一支，并且与序列相似度比对结果一致。另外序列相似度比对中未确定到种的单倍型Hap83和Hap84与多刺牡蛎以100%的置信值聚为一支，表明Hap83和Hap84这两个单倍型对应物种为多刺牡蛎，单倍型Hap82为小蛎属未定种。基于28SrRNA等位基因的聚类结果，除Hap3、Hap4、Hap15和Hap41以99%以上的置信值与已确定的物种明显的聚在一起外，其余单倍型均与同属的多种聚为一支；未获得COI序列的两个大陈岛牡蛎样品与密鳞牡蛎以100%的置信值聚为一支。

2.4 遗传距离分析

依据序列比对结果和系统发育分析，可以将232个牡蛎样品鉴定为3属9种和1个未定种（表2）。使用MEGA 6.06分别计算基于COI序列和28SrRNA序列的牡蛎两两之间的遗传距离。利用SPSS24绘制牡蛎各分类阶元的遗传距离箱线图（图3）。COI序列遗传距离分析结果表明种内、同属不同种间和属间的遗传距离未发生重叠，DNA间隙明显。其中种内遗传距离的平均值为0.008，种内遗传距离均小于0.020；同属不同种间的遗传距离平均值为0.108，最大值和最小值分别为0.177和0.025；属间遗传距离平均值为0.290，其最大值和最小值分别为0.317和0.246。符合Heber等（2003）认为的线粒体COI基因为DNA条形码的最小种间遗传距离为0.020的阈值［20］，从而进一步验证了利用COI序列进行牡蛎样品分子鉴定的适用性和准确性。

28SrRNA序列遗传距离分析结果表明，各牡蛎之间的遗传距离明显小于COI序列的遗传距离，种内遗传距离的平均值为0.011，最大值和最小值分别为0.082和0.000；同属不同种间的遗传距离平均值为0.014，最大值和最小值分别为0.104和0.001。种内遗传距离和同属不同种间遗传距离存在DNA重叠，无法用于牡蛎种阶元的分类鉴定。28SrRNA属间遗传距离平均值为0.077，最小值为0.044，除了少数属内遗传距离极值大于0.044外，大部分属内的遗传距离都小于0.044，因此，28SrRNA可以粗略的用于牡蛎属阶元的分类鉴定。

2.5 讨论

2.5.1 条形码适用性分析 由于牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，通过传统的形态学分类手段对牡蛎种类的准确鉴定存在较大困难［8］，因此研究人员很早就开始利用DNA条形码技术对其开展分类研究［21-22］。目前Genbank已经公开发表的牡蛎COI序列已经超过1 674条，50多种牡蛎可以确定到种。本研究通过测序获得的COI序列与已经公开发表序列进行相似性比较开展种类鉴定，其中97%的牡蛎样品可以鉴定到种。通过COI序列遗传距离分析可知，种内和同属不同种间的遗传距离未发生重叠，DNA间隙明显，适用于牡蛎种阶元的分类鉴定。28S rRNA的遗传距离分析表明种内遗传距离和同属不同种间遗传距离存在DNA重叠，无法用于牡蛎种阶元的分类鉴定，但可以粗略的用于牡蛎属阶元的分类鉴定。

图2 基于COI序列和28SrRNA序列通过UPGMA法构建的系统发育树Fig.2 Molecular phylogenetic tree based on COI and 28SrRNA gene sequences by UPGMA method

2.5.2 浙江沿海牡蛎的种类及分布 通过COI序列和28SrRNA序列与数据库序列的比对和系统发育分析，结果表明，浙江沿海共有3属10种牡蛎，不同牡蛎的空间分布情况存在差异。

熊本牡蛎出现在除清江养殖群体外的所有采样海域，主要生长在潮间带的中低潮区以及潮下带浅海区。本研究中熊本牡蛎的数量占总研究牡蛎数量的55%，在近岸采样海域其数量优势更加明显，为浙江沿海优势牡蛎种。以往的研究表明熊本牡蛎广泛分布在江苏以南包括海南岛在内的海域［15，23-24］，属于亚热带性种。

福建牡蛎出现在大陈岛、南麂岛、清江、霞关和象山5个采样海域，为浙江沿海牡蛎的第二大优势种，主要生长在潮间带中低潮区。文献记载福建牡蛎分布在浙江以南沿海［25］，其中核心分布区为广东和福建，属于亚热带性种。因其生长快，产量高和适应性强成为广东和福建的重要养殖贝类［4］，本研究的清江养殖牡蛎也均为福建牡蛎。

图3 牡蛎个体不同分类阶元的遗传距离箱线图Fig.3 Box plot of genetic distances for COI gene and 28SrRNA gene of oysters at different taxonomic levels

棘刺牡蛎和多刺牡蛎在大陈岛和南麂岛采样海域都有出现，其中多刺牡蛎还在霞关有分布且数量相对较多，两种牡蛎均生长在潮间带中低潮区。文献记载该两种牡蛎在浙江以南沿海均有分布［10，26］，属于亚热带性种。这两种牡蛎的左壳表面有半管状棘或者壳顶光滑棕褐色边缘有半管状棘而明显区别于不同属的其他牡蛎。

日本巨牡蛎在国内分布数量很少，目前仅在渤海湾、营口和舟山等地有零星报道［10，27］，主要生长在潮间带低潮区和潮下带浅海区，属于暖温带性种。本研究也仅在大陈岛的潮下带和南麂岛的低潮带的4个样品中有所发现。

疏纹牡蛎广泛分布于日本海域［28］，主要生长在潮间带低潮区和潮下带浅海［26］，属于暖水性种。本研究在大陈岛、南麂岛和嵊泗3个海岛的低潮带均有发现，表明该种在浙江沿海外侧海岛具有较为广泛的分布。

密鳞牡蛎在广东以北沿海均有分布［10］，主要生长在潮下带浅海区，属于广温广布种。本研究在大陈岛渔民底拖网样品中发现两个密鳞牡蛎。

近江牡蛎广泛分布于全国沿海河口附近的低盐区［29］，属于低盐广温广布种。本研究仅在大陈岛贻贝养殖区的养殖绳上获得1个样品，这可能与本研究在河口低盐区采样较少有关。

长牡蛎广泛分布于长江口以北沿海潮间带中低潮区及潮下带浅海区［26，30］，而在长江口以南地区鲜有分布报道，属于暖温带种。本研究在大陈岛港池码头获得1个样品。

小蛎属未定种采自南麂保护区核心区的中潮带，与NCBI已知序列的相似性比较发现该种在我国台湾地区也有分布。

表2 浙江沿海牡蛎的种类及分布Tab.2 Species and distribution of oysters in coastal Zhejiang

2.5.3 浙江沿海牡蛎的多样性 通过对浙江沿海7个采样海域的牡蛎DNA条形码鉴定结果分析各海域的牡蛎多样性水平，其中南麂岛海域的H′最高，其次是大陈岛和霞关，头门和清江海域的H′最低；J′为霞关海域最高，其次是南麂岛和大陈岛，嵊泗最低（表3）。

将本研究取样的浙江沿海6个野生牡蛎采集点按南北纵向和按离岸远近的水平方向划分进行多样性分析（表3）。南北走向上牡蛎的H′为浙南海域（南麂岛、霞关）＞浙中海域（大陈岛、头门）＞浙北海域（嵊泗、象山）；J′在浙南海域高于浙中和浙北海域，种类数为浙中海域最多，其次是浙南海域，浙北海域相对较少。本研究浙中海域的牡蛎种类数多于浙南海域，其主要原因是由于在大陈岛海域采集到了潮下带的牡蛎样品，其丰富的采样生境是导致种类数较多的重要原因。在离岸远近水平方向上，近岸（象山、头门、霞关）海域牡蛎和远岸（嵊泗、大陈岛、南麂岛）海域牡蛎在其种类数、J′和H′均表现为远岸大于近岸。浙江沿海不同海域牡蛎分布的多样性差异与浙江沿海前鳃类软体动物［31］以及其他潮间带底栖生物的多样性分布差异基本一致［32］。形成这种差异的主要原因可能是由于浙江沿海分布着两种不同的水系，即浙闽沿岸流控制的沿岸低盐水系和台湾暖流控制的外侧高盐水系［33］，近岸和远岸水系的差异导致了牡蛎近岸、远岸分布多样性的差异，外侧高盐水系自南向北影响强度逐渐减弱导致了牡蛎南北纵向分布多样性的差异。

表3 浙江沿海牡蛎的多样性指数Tab.3 Diversity indexes of oysters in coastal Zhejiang

目前为止仅有少数几个沿海地区较为系统的开展了牡蛎的DNA条形码分析鉴定，其中广西沿海共发现牡蛎7种［24］，福建沿海发现4种巨牡蛎属的牡蛎，且所有的种类均为亚热带性质的种类或者广温广布种类，没有北方暖温带性质的种类，牡蛎区系组成较为简单［23］；位于浙江以北的辽宁沿海共有巨牡蛎属牡蛎2种，分别为广温广布种和北方暖温带性质种类，牡蛎区系组成也较为简单［3-4］。相比较而言，本研究显示浙江沿海牡蛎有10种，种类多样性水平明显高于广西沿海；其中巨牡蛎属牡蛎有5种，巨牡蛎属的种类多样性水平高于福建和辽宁。同时浙江沿海的牡蛎不仅有广温广布种，还有南方亚热带性质种类和北方暖温带性质种类并存，牡蛎区系组成更加复杂。

浙江沿海所处的东海浅海在末次冰盛期由于海平面下降变成陆地与台湾岛相邻，而台湾岛外侧的基岩海床和东海泥质或砂质的海床差异明显，因此形成了台湾海峡北侧的东海与南侧的南海之间部分海洋生物的地理隔离。末次冰盛期后海平面上升使得已经产生分化的不同地理群体甚至已形成不同种或亚种的群体再次跨过台湾海峡而生活在一起［35-37］。

长江是亚洲第一大河流，长期以来长江口一带被许多研究学者作为海洋生物地理区系划分的分割线，张玺等（1963）认为长江口以北的软体动物主要为广泛分布的暖水性种和温带种，一些暖水性较强的种一般都停留在长江口以南，不进入黄渤海［38］；沈嘉瑞等（1963）认为东海的蟹类区系为热带性的，但是许多种类不能越过长江口而北上［39］。Dong等（2012）认为长江口限制了嫁（Cellana toreuma）幼体的向南扩散而形成不同的地理群体［40］。Ekman（1953）将中国的浙江以北和浙江以南的海域划归为两个动物地理区［41］。

由此可见，浙江沿海牡蛎种类的高度多样性和区系组成多样与浙江海域经历的地质历史事件以及紧邻长江口的特殊的地理位置密切相关。

3 结论

通过COI序列和28SrRNA序列与数据库序列的比对和系统发育分析，结果表明，浙江沿海共有3属10种牡蛎。其中巨牡蛎属5种分别为熊本牡蛎、福建牡蛎、近江牡蛎、日本巨牡蛎和长牡蛎，牡蛎属2种分别为疏纹牡蛎和密鳞牡蛎，小蛎属3种分别为多刺牡蛎、棘刺牡蛎和小蛎属未定种。各牡蛎物种在空间分布上存在一定差异，熊本牡蛎和福建牡蛎在浙江沿海由南至北，由近岸至远岸均有分布，为浙江沿海的优势牡蛎物种，其他牡蛎种类主要分布在离岸较远的海岛上。浙江各海域牡蛎的多样性分析表明H′的大小为浙南海域＞浙中海域＞浙北海域，远岸海域＞近岸海域。