血清miR-21在多囊卵巢综合征患者中的表达及临床意义*

连 梅 郭玉佳 陈丽红 陈剑锋 陈淑贤

福建医科大学附属第一医院妇产科，福建省福州市 350004

多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)是育龄期妇女最常见的内分泌疾病之一,发病率高达6%～8%,其中50%～70%的PCOS患者可引起女性生殖功能障碍和内分泌代谢紊乱[1-2]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类可调控转录水平基因表达的小分子非编码RNA，在卵巢激素的生成、卵泡生长发育、排卵以及黄体功能形成过程中发挥重要的调节作用，而激素水平及卵泡发育的异常是PCOS的主要临床特征[3]。近期的研究表明，miR-21在PCOS女性中表达异常，可能与PCOS的发病机制相关[4]。本研究通过检测血清miR-21在PCOS患者中的表达情况，分析其用于诊断PCOS的临床应用价值，旨在为PCOS的早期诊断及靶向治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2018年10月在我院未经治疗的初诊PCOS患者150例，年龄22～39岁，平均年龄(27.90±2.80)岁。根据胰岛素抵抗指数(Homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)将150例PCOS患者分为PCOS胰岛素抵抗组(n=96，HOMA-IR≥2.57)和PCOS非胰岛素抵抗组(n=54，HOMA-IR<2.57)。纳入标准：(1)符合2003年荷兰鹿特丹会议上修订的PCOS诊断标准；(2)不孕病史>1年；(3)配偶生殖功能正常。排除标准：(1)严重肝肾疾病、内分泌代谢疾病及其他结缔组织病；(2)全身炎性疾病、肾上腺疾病、高泌乳素血症；(3)近期有激素类药物服用史。另选择同期因男方因素不孕而接受体检的健康女性50例作为对照组，年龄23～37岁，平均年龄(27.60±2.50)岁。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取：空腹抽取静脉血3ml置于未加抗凝剂的离心管中，于室温2 500r/min离心15min，分2层，吸取上层血清400μl转移至1个EP管中，加入1ml提取剂(Trizol)，于-70℃保存。从-70℃冰箱取出上述保存在EP管的细胞，按照总RNA快速提取试剂盒说明书从中提取总RNA。

1.2.2 miR-21逆转录及RT-PCR：应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒逆转录已定量的RNA，选用U6作为内参，反应体系为15μl，反应参数为：16℃ 30min；42℃ 30min，85℃ 5min。在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反应体系为20μl：TaqMan MicroRNA Assay1.00μl，cDNA1.33μl，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00μl，ddH2O 7.67μl，混合后离心放入定量 PCR仪。扩增条件为：95℃预热10min，95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环，最后38℃延伸5s，实验重复3次。以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-21的相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3 检测指标：全自动生化仪检测空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)、总胆固醇(Total choiesterol，TC)、三酰甘油(Triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholestorol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholestorol，HDL-C)。

2 结果

2.1 PCOS组和对照组基线资料比较 PCOS组HOMA-IR明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。PCOS组和对照组的年龄、BMI、腰围、臀围、收缩压、舒张压、TC、TG、LDL-C、HDL-C及FBG比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 PCOS组和对照组基线资料比较

注：1mmHg=0.133kPa。

2.2 PCOS组和对照组血清miR-21表达水平比较 PCOS组血清miR-21表达水平为1.76±0.38，明显高于对照组的0.50±0.07，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 PCOS胰岛素抵抗组和非胰岛素抵抗组血清miR-21表达水平比较 胰岛素抵抗组血清miR-21表达水平为2.65±0.80，明显高于非胰岛素抵抗组的0.55±0.08和对照组的0.50±0.07，差异有统计学意义(P<0.01)。非胰岛素抵抗组和对照组血清miR-21表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 血清miR-21对PCOS的诊断价值 当血清miR-21表达水平取最佳截值为1.28时，其诊断PCOS的AUC为0.795(95%CI：0.734～0.854)，敏感度和特异度为76.4%和74.8%。见图1。

图1 血清miR-21表达水平诊断PCOS的ROC曲线

2.5 血清miR-21与HOMA-IR的相关性 Pearson相关分析显示，PCOS患者血清miR-21与HOMA-IR呈正相关(r=0.817，P<0.01)，对照组血清miR-21与HOMA-IR无明显相关(r=0.138，P>0.05)。

3 讨论

PCOS是青春期及育龄期最常见的一种复杂、多因素的内分泌紊乱性疾病，是引起育龄期女性不孕的主要原因，对育龄期女性生理心理健康造成严重影响[5]。miRNA作为转录后调控的内源性非编码小分子RNA，在正常或病理条件下的细胞和组织中发挥着重要的作用，能够调控多种生物过程，包括细胞增殖、发育、分化、死亡，DNA修复、免疫功能等，参与多种疾病的发生发展过程[6]。有研究表明，miRNA在PCOS的血液、卵泡液、颗粒细胞及卵泡膜细胞中异常表达，其可能通过调节生殖、激素分泌和代谢、细胞增殖和凋亡、卵巢卵泡发育相关基因而发挥其生物学功能，参与PCOS的发病[7]。Concha等[8]研究证实，miRNA可能通过其靶基因和通路影响卵泡的发育、颗粒细胞的凋亡、类固醇激素合成、胰岛素敏感性，从而影响PCOS的病理生理过程。另有研究认为，miRNA通过对胰岛素信号通路中的关键性蛋白丝裂原活化蛋白激酶、胰岛素样生长因子1、胰岛素受体底物、蛋白激酶B和促性腺激素释放激素进行调控，从而使通路异常，导致胰岛素抵抗，进而促进PCOS的发生和发展[9]。

本研究结果显示，PCOS组血清miR-21表达水平均明显高于对照组，提示血清miR-21在PCOS患者中呈高表达，对PCOS疾病发展具有促进作用。Naji等[10]研究也表明，miR-21表达水平与卵母细胞发育情况紧密相关，在PCOS患者颗粒细胞和卵泡液中异常表达，可能在PCOS的高雄激素状态的发病机制中起着关键的作用。本研究中胰岛素抵抗组血清miR-21表达水平均明显高于非胰岛素抵抗组，提示miR-21与PCOS患者胰岛素抵抗的严重程度有关，其表达水平越高，PCOS患者胰岛素抵抗症状越严重。相关性分析也显示，PCOS患者血清miR-21与HOMA-IR呈正相关，由此推测血清miR-21高表达与胰岛素抵抗相关，可能是PCOS患者出现胰岛素抵抗的重要病理机制之一。

本研究通过绘制ROC曲线评价miR-21表达水平对PCOS的诊断效能，结果显示当血清miR-21表达水平取最佳截值为1.28时，其诊断PCOS的AUC为0.795(95%CI：0.734～0.854)，敏感度和特异度为76.4%和74.8%，提示miR-21对PCOS诊断具有一定的临床应用价值。Jiang等[11]研究发现，与正常人相比，PCOS患者血清miR-21明显升高，通过靶向调控LATS1促进PCOS的进展，并可作为诊断PCOS的新型非侵袭性生物标志物。

综上所述，PCOS患者血清miR-21表达水平明显升高，miR-21高表达可能参与了PCOS患者胰岛素抵抗的发生发展，对PCOS诊断具有一定的临床应用价值。但miR-21在PCOS中的具体发病机制，尚需更多的临床实验研究进一步证实。