不同骨科植入物表面细菌早期黏附水平比较*

郭庆昕 李焕英 饶华春

福建省泉州市正骨医院 362000

骨科植入物是具有高度相容性和耐腐蚀性的特殊固体生物材料，广泛应用于人工关节置换、骨折内固定等骨科手术中，植入物相关感染成为骨科手术最为棘手的并发症之一，同时手术切口感染风险也因植入物的存在而大大增加。细菌在植入物表面黏附、增殖，并分泌胞外多糖等物质，形成生物被膜。生物被膜内的细菌可以逃避机体免疫力、抗菌药物的作用，形成迁延不愈的植入物相关感染。为防止植入物相关感染人们设计了多种方案，包括对手术部位和器械消毒的技术以及使用高度无菌的层流手术室。然而，植入物相关感染的发生率仍在0.2%～17.3%之间[1-2]。从临床角度出发，研究植入物表面生物被膜(biofilm)形成至关重要。生物被膜形成过程一般认为是两步模式：首先，细菌通过物理化学相互作用(范德华力、重力、静电排斥、离子间相互作用)快速地黏附在植入物表面上；其次，细菌增殖和累积，形成多层细胞团簇的表面分子[3-4]。

本研究拟比较骨科手术中常用的钛合金、不锈钢、钴铬钼合金及高分子聚氯乙烯4种材料表面表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌早期细菌黏附水平，为植入物相关感染的预防和控制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 样品制备 钛合金、不锈钢、钴铬钼合金及高分子聚氯乙烯试验材料委托纳通医疗公司制备，直径10mm、厚度1mm的圆片，所有样品均抛光处理。

1.2 主要设备 722分光光度计(上海精科)、酶标仪(TECAN)。

1.3 主要试剂 哥伦比亚血琼脂平板(郑州安图生物技术有限公司)、胰蛋白酶大豆肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)、结晶紫(BASO生物技术有限公司)。

1.4 实验菌株 表皮葡萄球菌(ATCC 35984)、铜绿假单胞菌(PA01)为本实验室保存。

1.5 实验方法

1.5.1 生物被膜培养:将实验菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板37℃孵育过夜，挑取单个菌落接种于胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养3h，使用分光光度计将菌悬液吸光值调至0.2(波长为600nm)，相当于1×105CFU/ml的菌悬液。将30片备好的样品加入200ml菌悬液中37℃孵育60min，使无菌PBS缓冲液轻轻漂洗两次，以去除游离和黏附不牢固的细菌。将样品转移入新鲜的TSB培养基中37℃继续孵育，分别在2h、4h、6h各取出10片样品进行下一步试验(其中5片用于1.5.2，5片用于1.5.3)。

1.5.2 生物被膜总量评估:将不同时间点样品采用无菌PBS缓冲液轻轻漂洗2次，自然风干，使用95%乙醇固定5min，固定的样品用0.5%结晶紫染色5min，蒸馏水洗涤样品以除去过量的染料。空气中自然风干后，将5片样品分别转移入含有1ml 95%乙醇无菌试管中。将试管以全速涡旋3min，充分脱色。将每管各取200μl悬液加入96孔微量细胞培养板中，使用酶标仪以OD=570nm的波长测量各孔吸光度值。

1.5.3 生物被膜活菌计数：将不同时间点样品采用无菌PBS缓冲液轻轻漂洗2次，自然风干，将5片样品分别加入含1ml 无菌PBS缓冲液的试管中。为了从样品中表面去生物被膜，将试管全速涡旋3min，超声处理5min，并再次全速涡旋3min。将含有生物被膜的溶液按10 000倍稀释，分别取10μl的稀释液，使用平板倾注法计数生物被膜中的活细菌数(CFU×106/ml)。

1.6 统计学方法 使用SPSS17.0统计软件分析不同材料之间的差异，吸光度值(n=5)和活菌计菌(n=5)以均数±标准差表示，统计分析使用单因素方差分析，P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物被膜总量 培养2h后，4种骨科材料表皮葡萄球菌形成的生物被膜总量钛合金(0.07±0.02)、不锈钢(0.08±0.02)、钴铬钼合金(0.06±0.02)、高分子聚氯乙烯(0.08±0.02)，差异无统计学意义(P>0.05)；铜绿假单胞菌形成的生物被膜总量分别为钛合金(0.13±0.02)、不锈钢(0.10±0.02)、钴铬钼合金(0.11±0.04)、高分子聚氯乙烯(0.13±0.04)，差异无统计学意义(P>0.05)。4h后，表皮葡萄球菌形成的生物被膜总量高分子聚氯乙烯(0.20±0.03)和不锈钢(0.18±0.02)高于钴铬钼合金(0.14±0.01)、钛合金(0.12±0.02)，差异有统计学意义(P<0.05)；铜绿假单胞菌形成的生物被膜总量中高分子聚氯乙烯(0.28±0.04)高于钛合金(0.21±0.03)、不锈钢(0.20±0.05)、钴铬钼合金(0.21±0.04)，差异有统计学意义(P<0.05)。培养6h后，表皮葡萄球菌初始黏附的生物被膜总量高分子聚氯乙烯(0.26±0.03)高于钛合金(0.21±0.03)和不锈钢(0.22±0.03)，最低为钴铬钼合金(0.17±0.01)，差异有统计学意义(P<0.05)；铜绿假单胞菌初始黏附的生物被膜总量高分子聚氯乙烯(0.37±0.05)高于钛合金(0.32±0.04)和不锈钢(0.29±0.03)，最低为钴铬钼合金(0.24±0.03)，差异有统计学意义(P<0.05)。三个不同观察点上铜绿假单胞菌形成的生物被膜总量均高于表皮葡萄球菌(P<0.05)。如图1、2。

图1 表皮葡萄球菌生物被膜总量

图2 铜绿假单胞菌生物被膜总量

2.2 生物被膜活菌数 培养2h后，观察的表皮葡萄球菌在4种骨科材料的黏附活菌数(CFU×106/ml)，钛合金(8±2)、不锈钢(9±3)、钴铬钼合金(6±2)、高分子聚氯乙烯(10±3)，差异无统计学意义(P>0.05)；铜绿假单胞菌黏附活菌数钛合金(15±3)、不锈钢(12±4)、钴铬钼合金(12±3)、高分子聚氯乙烯(13±5)，差异无统计学意义(P>0.05)。培养4h后，表皮葡萄球菌黏附活菌数高分子聚氯乙烯(21±4)大于不锈钢(15±3)、钛合金(12±3)、钴铬钼合金(12±3)，差异有统计学意义(P<0.05)；铜绿假单胞菌黏附活菌数为高分子聚氯乙烯(28±5)大于钛合金(23±4)、不锈钢(22±4)、钴铬钼合金(20±5)，差异无统计学意义(P>0.05)。培养6h后，表皮葡萄球菌黏附活菌数高分子聚氯乙烯(41±6)高于不锈钢(30±5)、钛合金(21±4)和钴铬钼合金(19±5)，差异有统计学意义(P<0.05)；铜绿假单胞菌黏附活菌数高分子聚氯乙烯(42±4)高于钛合金(37±5)和不锈钢(36±2)，最低为钴铬钼合金(31±3)，差异有统计学意义(P<0.05)。3个不同观察点上铜绿假单胞菌黏附活菌数均高于表皮葡萄球菌黏附活菌数(P<0.05)。如图3、4。

图3 表皮葡萄球菌生物被膜活菌数

图4 铜绿假单胞菌生物被膜活菌数

3 讨论

以往生物材料与细菌生物被膜早期黏附相关性的研究主要集中于生物被膜信息与表面光滑度之间的关系[5-6]，粗糙的生物材料表面为细菌黏附提供了更广泛的区域[7]。因此，为了准确地比较各种植入物表面的细菌黏附水平，笔者对所有试验材料进行抛光处理。培养2h观察的结果显示，2种实验菌株在不同的试验材料上均能形成生物被膜，并且形成的生物被膜总量和生物被膜活菌计数相似(P<0.05)，因此，笔者推测各试验材料的表面光滑度相似是2h观察到生物被膜总量和生物被膜活菌计数无显著差异的主要原因。

培养4h后，2种细菌在高分子聚氯乙烯表面的生物被膜总量均高于钛合金、不锈钢、钴铬钼合金(P<0.05)，表皮葡萄球菌的生物被膜活菌计数高分子聚氯乙烯表面也高于钛合金、不锈钢、钴铬钼合金(P<0.05)，但铜绿假单菌在4种试验材料上的生物被膜活菌计数差异无统计学意义(P>0.05)。金属材料本身释放的金属离子和化学结构可能具有抑制或延缓细菌早期黏附的功能，这可能是笔者观察到2种细菌在3种金属材料表面的早期黏附水平低于高分子聚氯乙烯的原因,但铜绿假单胞菌在液体培养中生长迅速，在高分子聚氯乙烯表面大量黏附的同时生物被膜内的细菌也开始出现凋亡,是造成本观察点上生物被膜活菌计数差异无统计学意义原因,但也未能排除实验误差。继续培养6h后，2种观察菌在高分子聚氯乙烯表面的生物被膜总量和生物被膜活菌计数均高于3种金属材料(P<0.05)，同时观察到钛合金和钴铬钼合金抑制细菌早期黏附的能力略优于不锈钢。

不同骨科植入物细菌早期黏附水平不能用某种单一因素来解释，而是多种因素共同作用的结果。研究表明不同植入物的化学组成、亲水性、表面自由能和Z电位等因素，都能影响细菌的黏附和早期生物被膜形成[8-9]。Schildhauer等报道，细菌对不同金属植入物的依从性不同[10]，可能是生物材料本身的理化特性决定的，例如金属材料释放的金属离子和某些特定的化学结构可能会抑制或延缓细菌的黏附和早期生物被膜形成；Tang等的研究显示，由于疏水作用力使得细菌更易黏附于生物材料的亲水表面[11]；在牙科领域的研究表明生物材料表面自由能影响着细菌的黏附功能[12-13]，van Pelt认为，表面自由能可能比结合力更直接相关[14]，因此其推测细菌较难于在具有低表面自由能的钴铬钼合金表面上的黏附和形成生物被膜。

综上所述，表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌在高分子聚氯乙烯表面早期黏附水平明显高于其他3种金属材料，这为骨科植入物相关感染的预防和控制提供实验依据。