CO2冷海水结合抗氧化剂处理对南美白对虾的保鲜效果

蔡燕萍,张莎莎,刘建华,丁玉庭,3,刘书来,3,*

(1.浙江工业大学海洋学院,浙江杭州 310014;2.国家远洋水产品加工技术研发分中心(杭州),浙江杭州 310014；3.浙江工业大学海洋研究院,浙江杭州 310014)

南美白对虾(Litopenaeusvannamei)又名凡纳滨对虾[1],是世界养殖产量较高的三大虾类之一,其肉质鲜美,高蛋白,低脂肪,备受消费者青睐。由于微生物极易繁殖,导致虾的鲜度品质下降;而虾体内酶的酶促反应致使虾表面出现黑斑,严重降低南美白对虾的食用品质和经济价值,开发一种安全、有效的保鲜技术,以延长南美白对虾的保鲜期,显得尤为重要。

近年来,大量的研究报道了虾类的保鲜方法,主要包括物理保鲜(低温、超高压、酸性电解水[2]、气调[3]、辐照等)、化学保鲜(化学保鲜剂、臭氧等)和生物保鲜(多酚、壳聚糖及各类生物提取物[4]等)[5]。物理保鲜普遍存在操作复杂、成本高、安全性不明确等因素,其推广使用有一定的困难。生物保鲜剂在生物中含量较低,其获取成本高,操作复杂,目前仍主要停留于实验室水平[6-7]。化学保鲜简单高效、成本低廉,但鉴于其在食品中残留量方面的安全性考虑,可将化学保鲜与其他保鲜方式结合使用,CO2和冷海水技术相结合应用于南美白对虾保鲜在国内外鲜有报道。本实验以南美白对虾为研究对象,利用CO2冷海水与抗氧化剂相结合浸泡处理,旨在探究南美白对虾的贮藏品质,筛选适合于南美白对虾的抗氧化剂,以达到最佳的保鲜效果,以期为后续研究奠定基础,为水产行业提供新的保鲜方法和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南美白对虾 购于杭州德胜市场,虾长11.5±0.5 cm,重9.0±1.5 g,将鲜活虾保活运至实验室,剔除死亡个体,选择大小均匀、鲜活无损伤个体;Tris、钼酸铵、亚硫酸氢钠、对甲基酚硫酸盐、三氯乙酸、马来酸、ATP钠盐等 均为分析纯,国药集团试剂公司;营养琼脂培养基 青岛海博生物技术有限公司;腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤核苷(HxR)、次黄嘌呤(Hx)等 均为色谱纯,Sigma公司。

DLSB-2050低温冷却槽 杭州市大卫科技有限公司;LDZX-40BI型自动电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安器械厂;Waters2695高效液相色谱仪 美国waters公司;PHS-3C型数显酸度计、752 N型紫外可见分光光度计 上海精科仪器有限公司;海厨SK2166高速组织捣碎机 上海赛康电器有限公司;TGL-16M高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机有限公司;DHP-9162 型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;TAXT Plus 物性仪 英国Stable Micro System公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CO2冷海水发生装置 如图1所示,在低温冷却槽中将人工海水(含盐量为3.3%)冷却至4 ℃,将冷海水经水泵灌入气液混合罐,通入CO2与冷海水混合,维持一定压力和时间,至CO2的浓度饱和,即为饱和CO2冷海水。通过15～20 min的气液混合后可以达到平衡,平衡压力为0.2 MPa,CO2浓度为0.533%[8]。

图1 CO2冷海水发生装置示意图

1.2.2 CO2冷海水结合抗氧化剂处理南美白对虾 饱和CO2冷海水中分别作如下处理:a. 未添加抗氧化剂组(对照组);b.添加抗氧化剂组(处理组):添加2% 4-己基间苯二酚(4-己基间苯二酚组);添加2%植酸(植酸组);添加2%葡萄糖酸-δ-内酯(葡萄糖酸-δ-内酯组)。将鲜活虾分别浸泡于以上四种饱和CO2冷海水中,24 h后取出,4 ℃贮藏,间隔2 d(0、2、4、6、8、10 d)取样分析。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 菌落总数测定 采用GB/T 4789.2-2016的方法。菌落总数的测定采用平板计数法。以lg CFU/g虾肉报告实验数据,菌落总数用TBC表示。

1.2.3.2 挥发性盐基氮测定 采用GB 5009.228-2016中的半微量凯氏定氮法测定。

1.2.3.3 K值测定 核苷酸关联物的提取:采用王远红等的方法[9],具体操作如下:取5.0 g 虾肉匀浆,加入15 mL 预先冷却至4 ℃的10%的高氯酸(PCA)溶液进行抽提,悬浮液离心(3000×g,10 min),收集上清液。所得沉淀再用5%PCA 溶液抽提后离心。合并两次上清液,用10 mol/L KOH 溶液将其中和至pH6.5～6.8,定容至50 mL,然后用孔径为0.45 μm滤膜过滤。滤液在-18 ℃下保存,供测定用。

液相色谱法测定K值:采用Ryder[10]的方法,并稍作修改。使用Waters 2695高效液相色谱仪,色谱柱为C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为0.05 mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲溶液,流速1 mL/min,检测波长254 nm,进样量10 μL。以外标法定量;ATP及其降解产物的标准品为:ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx标准品:纯度≥99.0%,测得的HxR、Hx量之和与ATP及其降解产物总量的百分比即为鲜度指标K值。

1.2.3.4 多酚氧化酶测定 多酚氧化酶(PPO)粗酶液的提取:采用陈鲁萍等方法[11]。称取10 g虾头,剪碎,加入25 mL预冷至4 ℃的0.05 mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.2,含1 mol/L NaCl和0.2%的Brij-35 聚环氧乙烯月桂酰醚),匀浆,提取液4 ℃搅拌抽提3 h,离心(4 ℃,10000 r/min,30 min),取上清液重复离心(参数同上)一次,弃沉淀,上清液即为PPO粗酶液。

PPO活力的测定:取0.05 mol/L、pH7.2的磷酸缓冲溶液4 mL,加入50 mmol/L邻苯二酚溶液1 mL,于30 ℃水浴中预热10 min。加入PPO粗酶液1 mL,摇匀后在波长410 nm处比色测定。酶液加入后开始计时,每30 s记录一次吸光度A随时间的变化值,以5 min内最初直线段的斜率(ΔA/t)计算酶活力。对照组中以蒸馏水代替粗酶液。重复测定6 次取其平均值。

式中,Y为不同抑制剂处理后虾头PPO活力,X为新鲜虾头中PPO活力。

1.2.3.5 感官评价 参考杨钟燕等[12]的方法。感官评定小组由5名感官敏锐并具有感官评定经验的人员组成,总分值在9分(极新鲜)和0分(完全腐败)之间,从肉质、外观、气味等方面进行评分,具体评分标准见表1,结果以三项总分计。

表1 感官评分标准Table 1 Standard of sensory evaluation

1.2.3.6 pH测定 采用GB 5009.237-2016食品pH的测定。将对虾去头、壳,用高速组织捣碎机捣碎,称取绞碎的肉5.0 g,加10倍体积煮沸冷却的蒸馏水摇匀,抽提30 min,过滤后用PHS-3C型数显酸度计测定滤液的pH。

1.2.3.7 剪切力测定 采用Brauer等[13]的方法。取处理后的南美白对虾,去头、去尾、去壳,剪切力测定需要切断虾尾前的第一段,因此将虾肉与剪切刀头垂直放置于样品平台上,刀头的下降速度为50 mm/min,记录图谱上的第一个主尖峰(通常是最高峰,代表剪切样品所需要的最大剪切力)。

1.3 数据处理

数据分析与结果绘图分别采用SPSS 17.0和Origin 8.0软件,数据均以平均值±标准差表示,方差分析采用Duncan法,显著性水平设置为0.05。

2 结果与分析

2.1 CO2冷海水结合抗氧化剂对菌落总数的影响

菌落总数(TBC)是评价食品腐败变质的重要指标之一,当TBC≤5 lg(CFU/g)为一级鲜度,≤5.7 lg(CFU/g)为二级鲜度,而菌落总数超过6 lg(CFU/g)时已不能食用,以此判定虾的货架期终点[14]。图2 为不同抗氧化剂对菌落总数的影响。从图2可以看出,鲜活南美白对虾的菌落总数为5 lg(CFU/g),冷藏至第2 d,处理组与对照组相比,菌落总数无显著差异(p>0.05),三个处理组的菌落总数呈现略微降低的趋势。这可能是由于贮藏初期,虾浸泡于CO2冷海水环境中,体内的嗜温菌在低温和CO2冷海水共同作用而部分死亡[15];同时处理组中抗氧化剂的添加也抑制了微生物的生长繁殖。贮藏2 d后,对照组和处理组的TBC均呈现增长趋势,处理组的增长速度慢于对照组(p<0.05)。贮藏后期,对照组中微生物大量繁殖,而添加抗氧化剂的处理组均存在不同程度的抑菌效果,第8 d时植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组的菌落总数分别达到5.29、5.38 lg(CFU/g);4-己基间苯二酚组在第6 d接近5.51 lg(CFU/g),而对照组在第8 d就已超过二级鲜度。贮藏10 d后,4-己基间苯二酚组、植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组的菌落总数分别达到5.99、5.78、5.82 lg(CFU/g),均已超过二级鲜度。由此可知,抗氧化剂在CO2冷海水中的应用可以明显抑制微生物生长,使货架期在原有的基础上延长2 d左右,且植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组优于4-己基间苯二酚组。

图2 不同抗氧化剂对菌落总数的影响

2.2 CO2冷海水结合抗氧化剂对挥发性盐基氮(TVB-N)的影响

根据GB 2733-2015规定:海水鱼虾的TVB-N含量≤30 mg/100 g。图3给出了贮藏期内南美白对虾TVB-N的变化趋势。新鲜南美白对虾TVB-N含量为9.7 mg/100 g。贮藏2 d以内处理组的TVB-N变化不大,均为一级鲜度,这与微生物变化趋势呈一致性。随着贮藏时间延长,各组TVB-N含量均显著增加(p<0.05),这与Li等[16]的研究结果一致。而处理组从贮藏2 d开始直至贮藏末期均显著低于对照组(p<0.05)。贮藏4 d后植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组TVB-N的增长速度显著低于4-己基间苯二酚组(p<0.05)。贮藏第8 d时对照组超过二级鲜度,而4-己基间苯二酚组、植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组的TVB-N分别为20.01、17.06、17.84 mg/100 g(p>0.05),贮藏10 d时接近二级鲜度。由图2、图3可知,TVB-N变化与菌落总数变化呈正相关性。这就说明植酸和葡萄糖酸-δ-内酯更适合于南美白对虾的保鲜处理,CO2冷海水中添加抗氧化剂在降低微生物生长繁殖的同时,能显著抑制南美白对虾TVB-N的生成。

图3 不同抗氧化剂对挥发性盐基氮(TVB-N)的影响

2.3 CO2冷海水结合抗氧化剂对K值的影响

K值表示核苷酸的自溶降解程度,也是最灵敏的虾鲜度指标。K值越大,表明海产品中的蛋白质等分解越严重,其鲜度越差。一般认为,K值≤20%时为一级鲜度,20%～40%为二级鲜度,超过60%为初期腐败[16-17]。图4为不同抗氧化剂对K值的影响。由图4可知,K值在贮藏过程中呈上升趋势。贮藏4 d后4-己基间苯二酚组、植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组的K值与对照组差异显著(p<0.05)。三个处理组保持一级鲜度的时间均比对照组延长2 d,其中植酸组、葡萄糖酸-δ-内酯组的保鲜效果优于4-己基间苯二酚组。这与三种抗氧化剂的作用原理有关,4-己基间苯二酚是虾蟹中公认的抗黑变剂[19],是多酚氧化酶的有效抑制剂[20]。植酸和葡萄糖酸-δ-内酯依靠其竞争性抑制或螯合金属离子,减弱内源酶的水解作用[20-21]。同时,植酸组和葡萄糖酸-δ-内酯组之间差异不显著(p>0.05)。贮藏4 d时对照组K值达到20.57%,超出一级鲜度;而处理组在贮藏6 d后超出一级鲜度;由图4可知,对照组在贮藏8 d时K值达到68.68%;超出二级鲜度;而三处理组的K值均在贮藏10 d达到60%以上,这与TVB-N和菌落总数的变化呈现正相关性。三种抗氧化剂与CO2冷海水的抑菌效果可知,植酸组和葡萄糖酸-δ-内酯组可以维持虾的新鲜程度在较好的范围内,4-己基间苯二酚组的效果次之。

图4 不同抗氧化剂对K值的影响

2.4 CO2冷海水结合抗氧化剂对多酚氧化酶活性的影响

多酚氧化酶(PPO)催化的酶促反应导致虾死后发生褐变,引起其感官品质下降,因此在评价保鲜效果时,多酚氧化酶活性的变化可作为重要的评价指标之一[23]。图5为不同抗氧化剂对多酚氧化酶相对活性(PPO)的影响。由图5可知,贮藏2 d后,所有样品组的PPO相对酶活性均逐渐降低(p<0.05),这主要是由于所处环境的pH所致。pH的变化显著地影响酶-底物是否可以顺利进行络合反应,因此低pH环境会降低酶的活性和褐变程度。贮藏2～4 d,三个处理组的相对酶活性下降程度显著快于对照组(p<0.05),这主要是由于抗氧化剂的添加加速了多酚氧化酶活性的下降[24],但三处理组的下降速度不同,这与不同抗氧化剂的抑酶活性有关。由图5中可知,贮藏2～6 d葡萄糖酸-δ-内酯组和植酸组抑酶效果优于4-己基间苯二酚组;而在贮藏6 d至贮藏末期,三处理组差异性不显著(p>0.05),且多酚氧化酶相对酶活性保持稳定。

图5 不同抗氧化剂对多酚氧化酶相对活性(PPO)的影响

2.5 CO2冷海水结合抗氧化剂对感官品质的影响

南美白对虾经不同抗氧化剂处理后,感官品质的变化如图6所示。由图6可知,随着贮藏时间的延长,南美白对虾的肉质与虾壳逐渐变软,体表出现黑斑,腐败气味增强,对照组、4-己基间苯二酚组、植酸组和葡萄糖酸-δ-内酯组南美白对虾的感官评分在贮藏期间均逐渐降低,且抗氧化剂处理组均显著优于对照组(p<0.05),植酸处理组的感官评分下降趋势最平缓。贮藏6 d时,对照组出现腐败气味,虾壳变软,色泽变暗,表面出现少量黑斑。对照组贮藏8 d时,出现较强腐败气味,虾体肉与壳连接松弛,虾头出现大面积黑斑,而三个处理组贮藏10 d时,虾体才出现黑斑,有腐败气味,且植酸处理组的黑变最少。因此,CO2冷海水结合4-己基间苯二酚、植酸和葡萄糖酸-δ-内酯的添加有助于延缓南美白对虾感官品质的下降。

图6 不同抗氧化剂对感官品质的影响

2.6 CO2冷海水结合抗氧化剂对pH的影响

图7为不同抗氧化剂对pH的影响。由图7可知,新鲜南美白对虾的pH为6.93,与其他文献报道有所不同,这可能与南美白对虾产地环境和成熟季节的差异有关。贮藏过程中pH呈现上升趋势,这是由于贮藏时间延长,微生物繁殖,产生了TVB-N和TMA等碱性化合物。Shamshad等[25]研究认为,虾体pH和鲜度有很好的相关性,并指出pH7.8是区分品质可否接受的关键点,因此检测虾贮藏期内的pH变化能间接反映虾品质变化。对照组pH上升速度最快,在第8 d时pH接近7.8,已不可食用;而4-己基间苯二酚组、植酸组和葡萄糖酸-δ-内酯组的pH变化差异不显著(p>0.05),均在第10 d达到7.8,处理组的货架期比对照组延长了2 d左右。这说明4-己基间苯二酚、植酸和葡萄糖酸-δ-内酯的添加抑制了微生物的生长,减缓了虾肉品质的降低。

图7 不同抗氧化剂对pH的影响

2.7 CO2冷海水结合抗氧化剂对质构的影响

各样品组在贮藏期间剪切力变化如图8所示。由图8可知,南美白对虾的剪切力随着贮藏时间的延长,呈现逐渐下降趋势。贮藏开始时虾体的剪切力均为17.15 N,随着贮藏时间的延长,对照组和三处理组的虾体剪切力均下降,这可能是由于贮藏期间虾体内源性酶、微生物源蛋白水解酶和胶原酶对虾体的分解作用所致[26]。三处理组的下降速度均比对照组慢,第10 d时对照组剪切力显著低于处理组(p<0.05),三处理组之间差异不显著(p>0.05)。

图8 不同抗氧化剂对剪切力的影响

3 结论

贮藏过程中抗氧化剂添加对南美白对虾均有较好的保鲜效果。添加4-己基间苯二酚、植酸、葡萄糖酸-δ-内酯的虾体,其菌落总数、TVB-N含量、K值、pH的增加速度明显低于对照组,多酚氧化酶活性受到抑制,各样品组的质构无明显差异。与对照组相比,CO2冷海水结合抗氧化剂处理后的南美白对虾货架期延长2 d。抗氧化剂的添加强化了CO2冷海水的保鲜效果,其中以植酸、葡萄糖酸-δ-内酯的效果为佳。该研究提出的CO2冷海水结合抗氧化剂的鲜技术可有效减缓南美白对虾的腐败变质,延长其货架期。今后可考虑进一步优化植酸和葡萄糖酸-δ-内酯的添加量、处理时间和贮藏温度等条件,从而获得最佳的南美白对虾保鲜方式。