氢氧化钡处理-二氯甲烷萃取/GC-MS/MS检测几种水产品和加工肉制品中的7种N-亚硝胺

翟孟婷,王宗义,郑 宇,候彤瑶,黄漫青

(1.北京农学院,食品科学与工程学院,食品质量安全北京实验室,农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室,北京 102206;2.中粮营养健康研究院有限公司,营养健康与食品安全北京市重点实验室,老年营养食品研究北京市工程实验室,北京 102209)

N-亚硝胺是一类在食品加工和贮藏过程中由亚硝酸盐和胺类物质作用形成的一类重要致癌性食品污染物[1-2]。目前,我国仅对N-亚硝基二甲胺(NDMA)在肉制品和水产动物性制品中的限量做出规定,分别为3和4 μg/kg[3],其他N-亚硝胺尚未限定。

食品中N-亚硝胺主要依赖色谱结合特异性高灵敏检测器或质谱进行检测,常见的检测方有气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)[4-5]、气相色谱-氮磷检测器法(GC-NPD)[6]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[7-8]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[9-10]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11-12]。其中,GC-MS/MS和LC-MS/MS由于具有优异的选择性和灵敏度,近年来应用报道较多,成为N-亚硝胺检测的主要方法。但由于食品基质复杂,目标物含量低,改进样品前处理仍然是N-亚硝胺检测方法研究的关键。检测亚硝胺经典样品处理方法是水蒸气蒸馏-液液萃取,也是现行国标法[5]采用的方法,具有基质效应小、富集倍数大的特点,但过程较长且有毒试剂用量大。改进的方法主要有水蒸气蒸馏-固相萃取[13]、分散液液微萃取[14-15]、分散固相萃取[16]和QuEChERS[9-10]等,或更为环境人员友好,或提高了检测效率。本文以稳定同位素标记N-亚硝胺为内标,通过氢氧化钡皂化处理结合二氯甲烷单次萃取,以及适当的样液浓缩方法,建立一种简便易行、相对成本较低的样品处理方法,再结合GC-MS/MS的高灵敏、高选择性,实现对几种加工肉制品和水产品中7种N-亚硝胺的有效检测,并进行实际应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼干(马口鱼、鲅鱼、银针鱼、黄花鱼、凤尾鱼、海燕鱼)、虾仁(金钩、海米和红虾)和加工肉制品(午餐肉、广味肠、腊肉、酱猪蹄、鱼肉肠、培根、烤肉和熏肠) 北京回龙观地区超市;氢氧化钡(八水)、硫酸钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;二氯甲烷 色谱纯,美国J.T.Baker公司;N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基二正丙胺(NDPA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基哌啶(NPIP)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)混合标准溶液(2000 mg/L,1 mL) 美国o2si公司;NDMA-d6甲醇溶液(1000 μg/mL,1 mL)、NDPA-d14 甲醇溶液(1000 mg/L,1 mL)、NPYR-d8甲醇溶液(1000 μg/mL,1 mL) 美国Accustandard Inc公司。

Agilent 7890B-7000C气相色谱-串联质谱联用仪 美国Agilent Technologies公司;Centrifuge 5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;RE-2000B旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;IKA MS 3 basic涡旋混匀器 德国IKA公司;BF-2000氮气吹干仪 北京八方科技世纪有限公司;MJ-WBL2501B搅拌机 广东美的生活电器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 将N-亚硝胺混合标准溶液、3种定值稳定同位素标记内标溶液,分别用二氯甲烷转移至10 mL容量瓶中,得各N-亚硝胺浓度均为200 μg/mL的混合标准储备液和NDMA-d6、NDPA-d14和NPYR-d8浓度均为100 μg/mL的混合内标储备液,于棕色贮液瓶中-18 ℃储存。用甲醇稀释混合标准储备液,得浓度分别为1、0.1 μg/mL的混合标准中间工作液;用甲醇稀释混合内标储备液,得浓度1 μg/mL的混合内标溶液。用二氯甲烷稀释混合标准中间工作液和内标溶液,得内标浓度为50 ng/mL,N-亚硝胺浓度分别为1、5、10、25、50和100 ng/mL系列混合工作液。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 皂化与萃取 取适量样品,预切成约1 cm3的小块,于样品粉碎机中绞碎至粉或糜状,称取绞碎混匀样品10 g于50 mL离心管中,加入50 μL混合内标溶液,静置5 min,加入3 g氢氧化钡(八水),去离子水30 mL,涡旋1 min,拧紧盖子于90 ℃烘箱处理2 h,取出10000 r/min离心10 min。将上清液倾入另一50 mL离心管,加入25 mL二氯甲烷,涡旋1 min后离心。弃去上层水溶液,下层二氯甲烷提取液通过盛有5 g无水硫酸钠玻璃漏斗(底部放少量玻璃棉),收集于100 mL鸡心瓶中,用5 mL二氯甲烷清洗离心管和无水硫酸钠,合并二氯甲烷提取液于鸡心瓶中。

1.2.2.2 浓缩方式的比较 采用旋蒸结合氮吹的方式进行,对如下三种方式进行比较:(a)将25 mL提取液在35 ℃旋蒸至5 mL,室温氮吹至1 mL,待测;(b)将25 mL提取液在35 ℃旋蒸至干,用1 mL甲醇复溶,待测。(c)将25 mL提取液在35 ℃旋蒸至1 mL,室温氮吹至近干,用1 mL甲醇复溶,待测。

1.2.3 色谱质谱检测

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱:DB-WAXUI(30 m×250 μm×0. 25 μm);进口样温度190 ℃,不分流进样,进样量1 μL;载气为氦气,恒流模式,流量0.9 mL/min;程序升温条件:35 ℃保持1 min,10 ℃/min升至90 ℃,30 ℃/min升至240 ℃保持6 min;传输线温度:250 ℃。

1.2.3.2 质谱条件 电子轰击电离源(EI);电离能量:70 eV;离子源温度:230 ℃;四级杆温度:150 ℃;采集模式:多重反应监测模式(MRM),见表1;溶剂延迟:5 min。

表1 N-亚硝胺的MRM参数Table 1 MRM parameters of N-nitrosamines

1.2.3.3 定性、定量分析 通过对目标物保留时间、母离子及两个二级离子响应比值与标样相应参数进行对照进行定量;以目标物相应稳定同位素标记内标物的浓度比(横标)与相应的响应比为(纵标)进行回归,制作校正曲线,内标法进行定量。NDMA、NMEA和NDEA以NDMA-d6为内标,NDPA、NPIP以NDPA-d14为内标,NPYR和NMOR以NPYR-d8为内标。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 线性关系、检出限和定量限 对浓度范围为1～100 ng/mL的系列标准溶液进样分析,绘制校正曲线和计算R2值,评价线性关系;对实际样品和加标样品的实际检测,以各分析物的定量离子对信噪比(Peak to Peak)分别为3和10,且定性离子对色谱峰能够被有效识别,评估检出限和定量限。

1.2.4.2 准确性与精密度 选取黄花鱼干、金钩虾仁和午餐肉三个代表性样品进行三水平、六重复添加回收实验,计算加标回收率和相对标准偏差。

1.2.5 样品测定 应用本方法检测市售17种样品,其中包括鱼干6种、虾仁3种和加工肉制品8种,每个样品重复测定两次。

1.3 数据处理

使用MassHunter workstation Acquisition/Qualitative/Quantitative Analysis Software Version B.07.04和Excel 2007进行相关数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 色谱分离与质谱检测

中等极性和强极性毛细管柱均适用于N-亚硝胺的是分离[10,13],但就食品基质而言,强极性柱优势较为明显,NDMA不易受共流出物的干扰。本实验使用DB-WAXUI 柱,典型分离色谱图如图1所示,7种N-亚硝胺分离良好,NDMA与基质中干扰物有效分离。质谱MRM参数,在参照样品基质干扰的情况下,对目标物的前级离子、碎片离子进行了选择,对碰撞能进行了优化,结果亦列于表1。

图1 标样及样品的MRM色谱图

2.2 样品前处理

2.2.1 皂化与萃取 研究表明,动物性食品中的脂肪可通过氢氧化钠溶液皂化处理,使N-亚硝胺转移至水溶液中[14-15,17],而氢氧化钡溶解度小,降温后迅速从溶液中析出,利于促进离心分离,且分离液清澈、粘度低,更有利于后续进一步活性炭固相萃取净化[18-19],但氢氧化钡用量超过1 g时容易析出堵塞小柱。本实验在文献[18]和[19]的基础上,增加氢氧化钡的用量至3 g,此时样品溶液达到饱和非常有利于二氯甲烷的萃取;又由于动物性食品脂肪含量较高,适当提高温度和处理时间有利于加速脂肪的皂化,当温度为90 ℃,处理时间为2 h时,样液中的脂肪层消失,皂化完全。由于实际定量分析应用的是目标物与稳定同位素标记内标物的浓度比,绝对提取量不影响定量结果,故离心后,上清液转至另一离心管中,经二氯甲烷一次萃取,即可满足检测的需要,二氯甲烷用量减至经典法的十分之一。又由于整个处理在50 mL离心管中进行,仅需两次离心、一次样液转移,即可完成皂化与萃取,使得方法较为简单,有利于多个样品的批量处理。

2.2.2 浓缩方式的比较 文献报道[20]和本实验研究均发现N-亚硝胺在减压浓缩和氮吹过程中容易发生损失,为优化浓缩方法,本实验对浓缩方式进行了考察,设计的3种浓缩方式的比较结果见图2。方式(a)的各目标物峰面积与参照标样对应峰面积的比值均高于其他两种方法,效果最佳。方式(b),即旋蒸至尽干,方式(c),即氮吹至尽干,都会使NDMA、NMEA等相对分子质量较小的目标物损失严重;而方式(b)和(c)的对比结果表明样品基质存在下,各目标物氮吹至尽干均较旋蒸至尽干目标物损失少,且相对分子质量越小损失越大。使用甲醇复溶样品,样液清亮,可进一步去除脂溶性物质,减小基质效应,但需要对二氯甲烷进行蒸干,造成目标物过度损失。综合上述,本实验选择方式(a)进行浓缩,即旋蒸至5 mL,氮吹至1 mL。

图2 浓缩过程对7种N-亚硝胺含量的影响

2.3 线性关系、检出限、定量限

根据实际样品的含量,对浓度范围为1～100 ng/mL标准溶液进行考察,绘制标准曲线,R2均大于0.999。检出限和定量限则根据实际样品和加标样品各分析物的定量离子对信噪比(Peak to Peak)分别为3和10且定性离子对色谱峰能够被有效识别、评估而得,分别为0.08～0.23、0.25～0.76 μg/kg。线性方程、检出限和定量限详见表2,参照肉制品和水产制品中NDMA的限量规定为3和4 μg/kg,该方法的检出限、定量限能够满足动物性食品中N-亚硝胺检测的需要。

表2 各化合物的线性方程、检出限和定量限Table 2 Regression equations,limits of detection and limits of quantification for the compounds

2.4 准确度和精密度

选取黄花鱼、金钩虾仁和午餐肉三个代表性样品进行三水平(n=6)添加回收实验,根据样品中N-亚硝胺的含量情况,设置两组添加水平(见表3),7种N-亚硝胺的回收率和相对标准偏差分别为71.6%～133.8%和2.04%～17.1%(亦见表3)。

表3 样品中7种挥发性N-亚硝胺的回收率及精密度(n=6)Table 3 The recoveries and precision of seven volatile N-nitrosamines(n=6)

2.5 实际样品的测定

应用本方法检测市场上6种鱼干,3种干制虾仁和8种加工肉制品,每个样品重复测定两次,结果列于表4。鱼虾样品中NDPA的检出率为100%,NDMA的检出率为88.9%，检出最高值为2.59 μg/kg;加工肉制品中NPYR和NDMA检出率为100%,NDMA含量范围在

表4 实际样品中7种N-亚硝胺含量Table 4 Contents of seven N-nitrosamines in actual samples

3 结论

本文建立了以稳定同位素为内标,氢氧化钡处理结合二氯甲烷萃取,GC-MS/MS检测几种水产品和加工肉制品中7种N-亚硝胺的新方法。氢氧化钡加热处理能有效去除样品中的脂肪,结合二氯甲烷单次离心管中萃取,有效简化了样品处理方法。方法在考察的浓度范围内(1～100 ng/mL)表现良好线性,R2均大于0.999,回收率为71.6%～133.8%,RSD为2.04%～17.1%。该方法简便易行、相对成本低,有毒试剂用量小,选择性好,有足够的检出限,能够满足鱼干、虾仁等水产品和午餐肉、香肠等加工肉制品中7种N-亚硝胺检测的需要。