山楂果胶低聚半乳糖醛酸(PGA)酸奶饮料工艺优化及PGA对乳酸菌的抑制作用

由 璐,赵艳雪,隋茜茜,刘士琦,刘素稳,常学东

(河北科技师范学院食品科技学院,河北秦皇岛 066604)

果胶作为食品的增稠剂和稳定剂在食品工业领域应用广泛,研究发现,果胶分解后的产物具有很强的抗菌活性,开发了果胶水解物作为新型的天然食品防腐剂[1]。Takenaka等[2]用柠檬果胶进行实验的结果表明,果胶分解后表达其抗菌性的本质产物是半乳糖醛酸寡糖。果胶寡糖(低聚糖)具有促进植物生长[3]、抑制食品腐败微生物繁殖[4-5]等多种功能,而且这些功能的强弱都与果胶寡糖的分子大小,即寡糖的重合度有关。

山楂(Crataegus),又称山里红、红果果,属蔷薇科山楂属[6]。山楂果实含有丰富的钙、铁、果胶及黄酮类物质,含量远超其它鲜果[7],因此具有极高的营养价值。但是由于山楂果实中有机酸含量较高,适口性较差,作为鲜果直接食用的比例较小。而我国由于加工技术的限制,对山楂果实的加工较为简单,加工后的产品主要有果丹皮、山楂糕和山楂罐头等食品。而这些简单的加工无法完全打开山楂制品的市场,影响了山楂的附加价值,造成了严重的资源浪费。据统计,我国山楂总量的15%～20%因贮藏时间过久而腐烂损失,因此国内亟需快速提升山楂果实的深加工技术加快山楂果实资源的高效开发与利用[8]。目前对山楂的功能研究多集中于多酚黄酮类成分[9],而山楂中果胶含量丰富[10],约占果实重量的2%～4% FW,其酶解产物低聚糖对病原微生物有很强的抑制活性,在天然食品防腐添加剂的开发领域中具有很大的应用前景。近年来,国内外已有学者研究山楂果胶的酶解物[11],但对山楂果胶低聚半乳糖醛酸(PGA)分离纯化最佳条件的研究鲜有报道。一部分学者证明了酶解液能够有效抑制腐败菌,但还需继续深入研究并将其抑菌及抗氧化性能应用于实际当中。

超微粉碎一般是指将直径为3 mm以上的物料颗粒粉碎至10～25 μm。物料经超微粉碎后能有效改善粉体的颗粒粒度及结晶结构。因此超微粉体具有独特的物理和化学性质,如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学活性等[12],超微粉碎有利于原料中营养成分的释放与吸收,超微粉产品的食品品质及加工性能够得到显著改善,功能性成分的溶出和吸收利用率得到提高,是一种理想的食品加工手段[13]。目前还没有发现关于山楂超微粉酸奶饮料的报道。因此,本研究利用PGA的抑菌功能,研制一种营养酸奶,以期能够延长其货架期。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山楂(承德一号) 于2016年采摘于河北省承德市兴隆县;伊利纯牛奶 昌黎兴龙广缘超市;乳酸菌复合发酵菌粉(保加利亚乳杆、菌嗜热链球菌) 北京川秀国际贸易有限公司;果胶酶(≥1000 U/mg) 上海源叶生物科技有限公司;硫酸 优级纯，永飞化学试剂有限公司;甲酸、异丙醇 色谱纯，天津市光复精细化工研究所;牛血清白蛋白 上海源叶生物科技有限公司;四硼酸钠 河北省保定化学试剂厂;营养肉汤NB(产品编号02-013) 青岛海博生物技术有限公司;MRS固体培养基(产品编号MFII05、MRS肉汤产品编号BS1137) 杭州百思生物技术有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

JJ-2型组织匀浆机 金坛市亿通电子有限公司;FE20型实验室pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;YP601N型电子天平 北京京海正通科技有限公司;TGL-20B型高速离心机 上海安亭科学仪器厂;723型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;LGJ-15D型冷冻干燥机 南京庚辰科学仪器有限公司;HJ-5型多功能恒温搅拌器 武汉格莱莫检测设备有限公司;N-1100型旋转蒸发仪、MG-2200型氮气吹扫仪 东京理化器械株式会社埃朗科技国际贸易有限公司;HH-4型数显数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞尔电器有限公司;VOS-301SD型真空干燥机 埃朗科技国际贸易有限公司;SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司;SK-1型快速混匀器 金坛市良友仪器有限公司;1200型高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;ESI-MS3000型质谱仪 美国热电公司;TMS-PRO质构仪 北京盈盛恒泰科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 果胶半乳糖醛酸制备

1.2.1.1 半乳糖醛酸混合物的制备 将果胶酯化,制成果胶酸后再进行酶解。果胶酸的制备方法:3 g山楂果胶溶于300 mL 50%乙醇溶液中,冰浴搅拌5 h后放入冰箱过夜。抽滤得到沉淀物,将所得沉淀物加入100 mL 50%乙醇溶液中,室温下用3 mol/L HCl调节pH至1.5,保持pH在2.0以下,继续搅拌30 min,抽滤得到沉淀物,向沉淀物中加入100 mL含1%HCl的50%乙醇溶液,室温下搅拌30 min,抽滤得到沉淀物,用50%乙醇溶液洗涤3次,抽滤、沉淀复溶于水,冷冻干燥得果胶酸[14]。取果胶酸500 mg加入0.05 mg/mL果胶酶50 mL(pH4.5醋酸钠缓冲溶液),45 ℃下酶解1 h。反应完成后沸水浴(8±1) min使果胶酶失活,4000 r/min离心10 min取上清液,得果胶半乳糖醛酸混合物[15]。

1.2.1.2 半乳糖醛酸树脂纯化 选用1.5 cm×40 cm玻璃层析柱,预先加入少量蒸馏水,再将活化好的Dowex1×4-400阴离子交换树脂装入玻璃柱中,静置到树脂完全沉降后,利用浓度为1 mol/L的甲酸溶液冲洗,目的是使pH降至酸性(pH=1.5左右)从而使树脂可以转化为HCOO-型,最后利用水洗,使树脂pH呈中性后结束操作[16]。

上样:将山楂果胶寡糖混合物调至弱酸性(pH=6.0)后加入树脂中,在注入过程中需要沿柱壁缓慢加入,保证山楂果胶寡糖混合物位于树脂上层。最后利用蒸馏水清洗柱壁,避免冲散玻璃柱内树脂。

洗脱:为了从山楂果胶酶解液中分离半乳糖醛酸寡糖,需要去除山楂果胶酶解液中的杂质和中性糖,因此需要利用蒸馏水进行清洗操作。待杂质和中性糖被清洗完毕后,利用甲酸铵溶液进行山楂果胶酶解液中半乳糖醛酸寡糖洗脱操作,以1 mL/min流速分部收集每管7 mL,其中甲酸铵溶液的浓度分别为0.16、0.32、0.48、0.64、0.8和1 mol/L。根据抗氧化性大小(DPPH法)确定目标低聚糖醛酸混合物,实验过程和结果见文献[17]。

1.2.2 ESI-MS分析 取少量果胶半乳糖醛酸混合物经微晶纤维素和阳离子交换树脂纯化后,HPLC-ESI-MS分析。样品进样量2 μL,ESI-MS分析的主要参数为:喷雾电压4 kV;鞘气30 Bar;辅助气5 Bar;离子传输毛细管温度为275 ℃;管透镜电压150 V[17]。

1.2.3 山楂超微粉的制备 在前期实验的基础上,采用正交实验设计优化的山楂微波真空膨化干燥工艺(初始含水量为(33%±2%),切片厚度为7.5 mm,真空压力为(-77.5±2.5) kPa,初始微波强度为25 W/g的条件下膨化效果最佳)进行干燥并用超离心(16000 r/min条件下，粉碎1次)研磨仪进行超微粉粹,得到超微粉体,备用[18]。

1.2.4 山楂活菌酸奶饮料工艺优化

1.2.4.1 工艺流程 牛奶加热煮沸5 min,加入适量蔗糖,搅拌均匀。使其温度快速冷却至40 ℃,加入一定量山楂超微果粉,自然冷却,在37 ℃下加入乳酸菌菌粉,充分搅拌,于42 ℃条件下恒温发酵5 h。后熟期加入PGA,在温度(4±2) ℃下后熟冷藏12 h[19-20]。

1.2.5 酸奶单因素实验

1.2.5.1 山楂超微果粉添加温度的确定 将500 g牛乳加热煮沸5 min,加入6%蔗糖搅拌均匀,分别取20 g牛乳,温度降至20、30、40、50、60 ℃时添加1.5 g山楂超微果粉,观察山楂超微果粉在乳中的分散情况。

1.2.5.2 山楂超微果粉用量的确定 将500 g牛奶加热煮沸5 min,加入6%蔗糖搅拌均匀,分别取20 g,在(40±1) ℃下加入1%、2%、3%、4%、5%山楂超微果粉,搅匀后测定pH,观察乳的变化。

1.2.5.3 乳酸菌菌粉添加量的确定 将500 g牛奶加热煮沸5 min,加入6%蔗糖搅拌均匀,在(40±1) ℃下添加2%山楂超微果粉,分装成5份,在37 ℃下分别添加0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%不同量的乳酸菌菌粉(菌粉的添加温度为37～42 ℃),在42 ℃下发酵5 h。后熟期加入1‰ PGA溶液搅拌均匀,在(4±2) ℃条件下后熟12 h。对产品进行感官评分、酸度和持水力的测定。

1.2.5.4 糖添加量的确定 将500 g牛奶加热煮沸5 min,分装5份,按鲜奶质量的4%、6%、8%、10%、12%,添加不同量的蔗糖,在(40±1) ℃下添加2%山楂超微果粉,37 ℃下添加0.25%乳酸菌菌粉,搅拌均匀,在42 ℃下发酵5 h。后熟期加入1‰ PGA溶液搅拌均匀,在(4±2) ℃条件下后熟12 h。对产品进行感官评定、酸度和持水力的测定。

1.2.5.5 PGA添加量的确定 将500 g牛奶加热煮沸5 min,加入6%蔗糖,在(40±1) ℃下添加2%山楂超微果粉,37 ℃下添加0.25%乳酸菌菌粉搅拌均匀,在42 ℃下发酵5 h。后熟期加入1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的PGA,在(4±2) ℃条件下后熟12 h。对产品进行感官评定、酸度和持水力的测定。

1.2.6 正交试验 根据单因素实验得出最佳山楂超微果粉的添加温度为(40±1) ℃,添加量为2%,乳酸菌菌粉添加量为0.25%,蔗糖添加量为6%,PGA添加量为2‰。根据单因素实验结果,以蔗糖添加量(A)、乳酸菌菌粉添加量(B)、PGA添加量(C)三个因素为考察因素,每个因素设置三个水平,设计L9(33)正交试验设计来探索山楂果粉酸奶制作的最佳条件,正交因素与水平见表1[21]。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 感官评定标准 根据酸奶的色泽、组织状态、气味和滋味设计出酸奶饮料的感官评分标准[22],见表2。

表2 酸奶感官评定标准Table 2 Yogurt sensory evaluation criteria

1.2.8 酸奶理化指标测定

1.2.8.1 持水力测定 称量空的离心管其质量记为W0,取一定量的酸奶待测样品放入离心管中[23],并称量样品W1后,放入离心机,以3000 r/min离心30 min,除去上清液,称量残余物的重量W2,酸奶的持水力按下式计算:

其中,W0为空的离心管其质量,W1为离心管及样品质量,W2为残余物的质量。

1.4.8.2 酸度的测定 称取10 g(精确到0.001 g)样品,置于洗净干燥的150 mL锥形瓶中,加入蒸馏水约20 mL,再加入2.0 mL酚酞指示剂,小心摇匀,利用NaOH标准溶液滴定至微红色,在30 s内不消失,记录消耗的NaOH的体积,并将其代入公式计算[24]。

试样中的酸度数值以(°T)表示,按下式计算:

其中:X2为试样的酸度,°T;c2为NaOH标准溶液的浓度,mol/L;V2为消耗NaOH的体积数,mL;m2为样品质量,g;0.1为标准NaOH溶液的摩尔浓度,mol/L。

1.2.9 PGA对酸奶货架期的影响 当试验温度为30 ℃时[25]，通过观察酸奶酸度的变化可以推算出酸奶在常温(25 ℃)条件下的货架期，并且可以得到添加PGA后酸奶酸度的变化情况。

1.2.10 PGA对乳酸菌增殖作用的影响

1.2.10.1 乳酸菌菌种的活化及保存 采用GB 4789.35-2010乳酸菌检测法[26],对超市购买的君乐宝乐畅酸奶进行菌落总数检测。接种到MRS肉汤培养基中37 ℃厌氧培养24 h备用。接种到MRS固体斜面培养基上37 ℃厌氧培养24 h保存。

1.2.10.2 PGA作用下乳酸菌的生长状况 在无菌环境下,用营养肉汤培养基制备不同浓度的2‰、4‰、6‰、8‰的半乳糖醛酸溶液培养基,以不含半乳糖醛酸的培养基作为空白。在120 ℃下灭菌20 min。将5 μL预先活化好的菌体接种到灭菌后的液体培养基中。置于恒温振荡器﹙37 ℃,180 r/min﹚中振荡培养,24 h后测量培养液在 600 nm下的OD值并比较不同浓度半乳糖醛酸下的菌落数[27-28]。

1.2.11 质构仪测试条件 测试探头:38.1 mm柱形探头;测前行进速度:60 mm/min;测中行进速度:30 mm/min;测后行进速度:120 mm/min;力:0.1 N;停留时间:2 s;压缩程度:60%。

1.3 数据处理

为了保证实验结果能满足重复性要求,所有结果都经过三次以上实验求取平均值所得,并排除了粗大误差的影响,实验结果以“平均值±标准偏差”表示。所有数据采用SPSS 13.0软件包进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 ESI-MS分析

2.2 酸奶饮料单因素实验

2.2.1 山楂超微果粉对不同温度牛乳的影响 在不同温度的牛乳中添加山楂超微果粉,果粉在牛乳中的分散状况以及牛乳的状态有很大的差异,如表3所示[29]。

表3 山楂超微果粉对不同温度牛乳的影响Table 3 Effect of hawthorn ultrafine fruit powder on milk at different temperatures

结果表明山楂超微果粉在牛乳中的分散状况随着温度的提升而更易搅拌均匀分散,然而随着温度的提升而导致牛乳粘稠性有很大的差异,20～30 ℃时的粘稠性较大,40 ℃及以上牛乳的粘稠性无显著性差异(p>0.05)。考虑酸奶的发酵温度是40～43 ℃,所以选择在杀菌乳冷却至(40±1) ℃时添加山楂超微果粉。

2.2.2 不同山楂超微果粉添加量对牛乳pH的影响 超微果粉添加到鲜乳中,山楂本身的酸性使得牛乳的pH下降,部分牛乳中的酪蛋白变性,影响牛乳的发酵凝结。山楂超微果粉添加量对牛乳pH的影响如表4所示。

表4 不同山楂超微果粉添加量对牛乳pH的影响Table 4 Effect of different hawthorn ultrafine fruit powder addition on pH of milk

表4结果表明,山楂超微果粉添加量达3%以上时,牛乳pH已接近或降至酪蛋白的等电点4.6以下,牛乳中已有较多的沉淀出现,因此确定山楂超微果粉添加量为2%。

2.2.3 乳酸菌菌粉添加量对酸奶酸度、持水力和感官评分的影响 不同菌粉添加量对酸奶的口感和组织状态有很重要的影响,通过对不同菌粉添加量制作酸奶的感官评分、持水力以及酸度进行测定,确定合适的菌粉添加量。由图1可知,酸奶的酸度随乳酸菌添加量的增加而升高,当添加量达到0.2%后,酸度基本不变;其持水力各组无显著差异(p>0.05),均保持在70%左右;随乳酸菌添加量的增加,感官评分升高,添加量为0.25%时,感官评分最高。此时酸奶的口感和组织状态最佳;通过酸度和持水力可得知,乳酸菌菌粉添加量在0.25%时,酸奶酸度和持水力均在最适值附近,因此乳酸菌菌粉的最佳添加量为0.25%。

图1 菌粉添加量对酸奶酸度、持水力和感官评分的影响

2.2.4 蔗糖添加量对酸奶酸度、持水力和感官评分的影响 合适的糖酸比对酸奶的风味非常重要,通过对不同蔗糖添加量制作酸奶的感官评分,持水力以及酸度进行测定,确定合适的蔗糖添加量。如图2所示,酸奶的酸度随蔗糖添加量的增加而升高,但维持在80 °T左右;其持水力各组无显著差异(p>0.05),均保持在70%左右;蔗糖添加量为6%时,感官评分最高,继续添加蔗糖其感官评分下降,酸奶的口感和组织状态变差。冷却后熟后感官评分、酸度的变化说明蔗糖添加量为6%时,酸奶风味最佳,山楂果味明显。

图2 蔗糖添加量对酸奶酸度、持水力和感官评分的影响

2.2.5 PGA添加量对酸奶酸度、持水力和感官评分的影响 合适的PGA不仅可以改善山楂超微果粉酸奶的风味,还可以延长酸奶的货架期。通过对不同PGA添加量制作酸奶的感官评分、持水力以及酸度进行测定,确定合适的添加量。如图3所示,酸奶的酸度随PGA添加量的增加而升高,酸奶的口感逐渐变得酸涩,这是由于PGA本身的味道所致;其各组持水力逐渐降低,在PGA添加量为4‰时,持水力最低;PGA添加量为2‰时,感官评分最高,继续添加PGA感官评分下降。根据冷却后熟之后感官评分、酸度以及持水力的变化综合考虑PGA的最适添加量为2‰。

图3 PGA对酸奶酸度、持水力和感官评分的影响

2.3 酸奶饮料工艺优化

A、B、C是影响酸奶感官评价的三个主要因素,在表5中分析了三者k值的变化规律和极差R值,三者的影响程度顺序为B>C>A。其中菌粉添加量的影响最大,是主要的影响因素,PGA添加量的作用次之,蔗糖添加量的作用相对较小。最佳配比为A3B2C2,即杀菌后牛乳加入7%的蔗糖、2%的山楂超微果粉、0.25%的乳酸菌菌粉,42 ℃发酵时间5 h后加入2‰ PGA,低温后熟。酸奶色泽均匀一致,有光泽,组织细腻,质地均匀,酸甜适中,具有浓郁的酸奶香味。

表5 L9(33)正交试验结果Table 5 Results of L9(33)orthogonal design

2.4 PGA添加量对酸奶货架期的影响

其中酸奶储存在低温环境时,可以在一定程度上抑制其中乳酸菌的增殖,但是依旧可以在β-半乳糖苷酶等酶的催化下产生乳酸,从而增加酸奶的酸度。并且乳酸菌仅是被低温抑制了活性,在存储温度升高后,乳酸菌的活性增加,提升乳糖到乳酸的转化过程,使酸奶的酸度增加。从图4中可以看出,在30 ℃下酸奶的酸度持续上升,在第7 d时不含PGA的酸奶的酸度提升了48.6 °T,增加了68.3%。而添加了PGA的酸奶,在第7 d时的酸度增量则为39.1%～59.3%(p<0.01)。同样是在30 ℃环境下,未添加PGA的酸奶的酸度要比添加2‰ PGA的酸奶高8.7%,即添加2‰ PGA的酸奶在第7 d的酸度仅相当于未添加状态下第5 d的酸度,因此PGA在抑制酸奶酸度方面有着较为优异的效果。从实际对比中也可以看出,未添加PGA的酸奶在第7 d时会产生严重的分层变质和酸味;而添加PGA的酸奶的组织状态完好且没有不良气味产生。添加PGA可有效延长酸奶的货架期。

图4 30 ℃下PGA添加量随时间酸奶的酸度变化

2.5 PGA对乳酸菌的抑制作用

图5为不同PGA下乳酸菌的生长情况,随着PGA浓度的增加,乳酸菌的菌落逐渐减少,差异显著(p<0.05)。

图5 不同浓度PGA对乳酸菌的影响

从图5、图6中可以看出,PGA对乳酸菌有很强的抑制性,并且与PGA含量呈正相关。从实验数据中可知,未添加PGA时乳酸菌的OD值为0.123,当向其中添加含量为2‰～8‰的PGA后,对乳酸菌OD值的抑制率高达23.6%～57.7%(p<0.01)。其中研究资料表明,PGA的抗菌性与其本身的聚合度呈负相关,即聚合度越低,PGA的抗菌性越强[30],这与实验结果相悖。通过深入研究后发现,聚半乳糖醛酸的抗菌性能不仅与其分子量相关还与菌株有关,即细菌只有在特定分子量的聚半乳糖醛酸作用下才表现出抑菌性。在本文中,所研究的PGA聚合度为3、4、5、7、9,其中抗菌性随PGA聚合度的增加而提升,与前人研究结果一致[31]。本实验为了保持产品中乳酸菌的活性,选用较低的添加量2‰。

图6 PGA对乳酸菌的影响

3 结论

山楂PGA酸奶的最佳配方为蔗糖7%、山楂超微果粉2%、乳酸菌菌粉0.25%、低聚半乳糖醛酸2‰。制备的酸奶色泽均匀一致,有光泽,组织细腻,质地均匀,酸甜适中,具有浓郁的酸奶香味。酸奶中添加山楂超微果粉不仅增添了酸奶的种类,还改善了酸奶的风味。PGA的加入使山楂酸奶的风味更佳浓郁,由于PGA对乳酸菌的抑制作用,使酸奶的货架期得到了相应的延长,并保持乳酸菌的活性。因此可以说明经PGA改善的山楂超微果粉活菌乳饮料符合人们的需求。值得注意的是,适宜菌粉的添加温度为37～42 ℃,本文在实验中,为了保证菌粉的活性,选择在低温温度37 ℃下添加菌粉。但低温37 ℃下添加菌粉后,需要在42 ℃下进行发酵,这就需要对溶液进行加热操作,增加了实验中所需的总能耗。而在实际的工业生产中,可以通过在高温温度40 ℃时添加菌粉来降低总能耗。