响应面-主成分分析法优化仙人掌发酵酒工艺

肖世娣,王 菁,薛逸轩,张惠玲

(宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室,宁夏大学,宁夏银川 750021)

米邦塔食用仙人掌不仅营养丰富,而且具有较高的药用价值,富含丰富的蛋白质、矿物质、纤维素[1]和维生素C等,并含有多种活性功能成分,如黄酮、多糖、生物碱等[2]。米邦塔食用仙人掌具有较高的药用价值,能够抗病毒、抗炎、抗糖尿病(II型)、以及抗高脂血症和高胆固醇血症[3],1998年被我国农业部作为一种蔬菜引入国内[4],至今宁夏吴忠成为其全国种植面积最大的种植基地。

我国对仙人掌的研究较少,主要集中在仙人掌片活性物质方面,例如黄酮的提取工艺[5]、抗炎功效[6]、仙人掌多糖的组成成分[7]、提取工艺及抗炎功效[8]等。国外仙人掌的食用主要是鲜食[9],在我国还未广泛推广,以仙人掌片作为原料发酵成酒研究也甚少。本研究以黄酮、总酚物质为指标,优化发酵工艺,以最大程度地保留仙人掌有效成分,酿制出清香、营养健康、具有仙人掌典型风格的发酵型酒仙人掌酒。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米邦塔食用仙人掌片(宁夏吴忠仙人掌种植基地)、酵母Excellence FTH-卓越 FTH 宁夏诺盟集团有限公司;降粘用酶 宁夏和氏璧生物技术有限公司;亚硫酸(食品级) 宁夏伟民生物有限公司;蔗糖 新百超市(宁阳店)。

LDZX-40C型自动立式电热压力蒸汽灭菌器 北京恒奥德仪器仪表有限公司;HHS型电热恒温水浴锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PHS-2C数显酸度计 杭州奥利龙仪器有限公司;LRH-150B型恒温培养箱 广东泰宏君科学仪器股份有限公司;RZ-988T型打浆机 深圳五联通达科技有限公司;AL204型分析天平 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;UV2000紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 仙人掌发酵酒酿造工艺流程

操作要点:选择新鲜无腐烂变质的仙人掌清洗后去刺,流动清水漂洗2次,备用。将清洗好的仙人掌根据料水比要求称量,切成2 cm长的块,置于打浆机中,按照设定料水比的不同,加水混合打浆得仙人掌浆。通过预实验获得最佳降粘酶的用量为0.5%,通过降粘酶使仙人掌汁在45 ℃水浴酶解3 h后在50 ℃水浴酶解2 h,测得仙人掌汁的可溶性固形物为0.5%～1%,pH为4～4.5。根据仙人掌发酵酒酒精度的要求,用蔗糖调整到要求。用20%柠檬酸调酸至酵母适宜生长pH为3.5。称取所需用量的酵母,加入10倍的无菌水,在37 ℃的条件下活化30 min,接种发酵。每天手动搅拌排气2次,直至基本无气泡产生,发酵结束过滤澄清,获得仙人掌发酵酒。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 料水比对仙人掌酒发酵的影响 通过预实验确定的单因素实验基本条件为:发酵温度20 ℃、初始糖度25%、酵母接种量0.05%,料水比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7进行接种发酵,发酵结束测定黄酮与总酚含量。

1.2.2.2 酵母接种量对仙人掌酒发酵的影响 确定料水比1∶4、发酵温度20 ℃、初始糖度25%,酵母接种量分别为0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%进行接种发酵,发酵结束测定总酚和黄酮含量,并进行感官评价。

1.2.2.3 初始糖度对仙人掌酒发酵的影响 确定料水比1∶4、酵母接种量0.05%、发酵温度20 ℃,初始糖度分别为15%、20%、25%、30%、35%进行接种发酵,发酵结束测定酒精度和黄酮、总酚含量。

1.2.2.4 发酵温度对仙人掌酒发酵的影响 确定料水比1∶4、酵母接种量0.05%、初始糖度25%,发酵温度分别为15、20、25、30、35 ℃进行接种发酵,发酵结束测定黄酮和总酚含量并记录发酵时间。

1.2.3 响应面试验设计 在单因素实验的基础上,以影响仙人掌发酵酒的料水比(A)、酵母接种量(B)、初始糖度(C)、发酵温度(D)为考察因素,以规范化综合得分为响应值,根据Box-Behnken实验设计原理设计响应面试验,实验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factor and level table for response surface experiment

1.2.4 酒精度测定 采用密度瓶法[11],将酒样恒温至20 ℃,用洁净干燥的容量瓶准确量取100 mL于500 mL蒸馏瓶中,用50 mL蒸馏水分三次洗涤容量瓶,洗液并入容量瓶,加入三粒玻璃珠,通过蒸馏装置缓慢加热蒸馏,收集流出液接近刻度线,恒温20 ℃,补加蒸馏水至刻度线,用干燥密度瓶进行称量,根据流出液密度公式进行计算密度,对照酒精水溶液密度与酒精度对照表确定乙醇含量(20%)。

1.2.5 黄酮含量的测定 分光光度法[12],取5 mL酒样于20 mL容量瓶,加入3.25 mL无水乙醇超声(10 W,50 Hz)处理30 min制得待测液,吸取待测液 1 mL于25 mL容量瓶,分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀,静置6 min;再加入10%硝酸铝溶液1 mL,摇匀,静置6 min,加入1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL,再加蒸馏水至刻度线,在波长510 nm处测定吸光值。用芦丁为当量制作标准曲线,根据标准曲线算出样品的总黄酮当量(μg/mL)。

1.2.6 总酚含量的测定 福林酚法[13],取1 mL 酒样于15 mL试管,分别加入1 mL福林酚显色剂,3 mL 20%碳酸钠溶液,混匀,50 ℃水浴30 min,冷却至室温,760 nm处测定其吸光值,以没食子酸为当量制作标准曲线,根据标准曲线算出样品的总酚当量(μg/mL)。

1.2.7 总酸的测定(以柠檬酸计) 滴定法[14],取2 mL酒样置于50 mL锥形瓶中,加蒸馏水值刻度线,再加入两滴酚酞指示剂,立即用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液滴定,30 s不褪色,记录氢氧化钠的体积进行计算。

1.2.8 总糖的测定 3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法[15],取酒样1 mL置于15 mL具塞试管中,加入1∶1盐酸7 mL,80 ℃水浴30 min,加2 mL DNS试剂,沸水煮沸2 min,冷却,再加蒸馏水至刻度线,在540 nm处测定吸光度值,以葡萄糖为当量制作标准曲线,根据标准曲线算出样品的总糖当量(mg/mL)。

1.2.9 微生物指标 食品卫生微生物学检验 酒类检验:GB 2758-2012[16]。

1.2.10 感官评价方法 根据国标方法[11],由20名食品专业研究生组成感官分析小组。参照宋琳琳等[17]的方法并进行相应调整,满分100,结果取平均值,评价标准见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Standard of sensory evaluation

1.3 主成分提取与数据处理

对仙人掌发酵酒的各指标进行了主成分分析,得到原始数据的贡献率、累计贡献率及特征值,将大于1的特征值因子作为主成分提取标准[18]。根据特征向量值(各自主成分载荷向量除以各自主成分特征值的算术平方根,即为特征向量值)确定各自主成分对应的指标。按式(1)计算仙人掌发酵酒各个实验组的综合得分F,再按公式(2)将得到的综合得分F进行规范化处理得到规范化综合得分Z[19]。

式(1)

式(2)

式中:F为综合得分,Y1、Y2、Y3为主成分的特征值,F1、F2、F3为仙人掌发酵酒的主成分1、2、3的得分,C为累积特征值,Z为规范化综合得分,Fmax为综合得分中最大值,Fmin为综合得分中最小值。

响应面试验设计以及结果分析用Design-Expert 10.0软件进行处理,主成分进行因子分析采用SPSS 20.0软件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料水比对发酵的影响 由图1可知,加水比例增大,黄酮、总酚等有效成分含量在酒中的比例都会降低,但加水少时,由于仙人掌中粘多糖含量高,制得的仙人掌汁粘稠,发酵会受到影响,同样会影响黄酮、总酚的溶出。因此,实验最终选择料水比1∶4比较好,既不影响发酵又可使黄酮、总酚尽可能地达到较多的含量。

图1 料水比对仙人掌发酵酒发酵的影响

2.1.2 酵母接种量对发酵的影响 由图2 可知,随着酵母接种量增大使酵母的生长速率、发酵速率、发酵周期和呼吸率都发生了变化,发酵速率变快,代谢加强,酵母之间的竞争激烈,温度不断升高,甚至代谢系统紊乱,发酵体系的变化使黄酮、总酚的稳定性发生变化,造成其含量下降。同时由于接种量的变化,使得代谢速率的快慢发生变化,对代谢产物种类和含量也有了一定的影响,对酒体的风味口感造成影响,通过感官品评以及对黄酮与总酚含量的衡量,实验确定了最佳接种量为0.05%。在此接种量下酒体澄清,酒香、纯正浓郁,酒中黄酮和总酚含量相对较高,接种量太小发酵速度缓慢,发酵周期太长,黄酮和总酚含量受到影响。

图2 酵母接种量对仙人掌发酵酒发酵的影响

2.1.3 初始糖度对发酵的影响 由图3可知,在一定条件下,初始糖度的确定决定着合适的酒精度。糖度过大过小都会对酒的品质有影响。糖度过大发酵液的渗透压增加,酵母菌受到抑制,使发酵不彻底,甚至产生副反应[20],其口感也下降。糖度太低，酒度过低,酒的口感寡淡,也会影响对黄酮、总酚的溶出。通过实验表明,当初始糖度为25%时,发酵酒度适中,黄酮、总酚含量相对较好,酒体协调,酒味浓郁,仙人掌的风味比较典型,因此,确定25%为发酵最佳初始糖度。

图3 初始糖度对仙人掌发酵酒发酵的影响

2.1.4 发酵温度对发酵的影响 发酵温度极大地影响着酵母的代谢产物以及发酵速率[21]。温度高,酵母生长快,发酵时间短,但产物积累过快,风味欠佳。温度低,酵母生长缓慢,代谢产物的合成积累时间充分,酒的风味较好。同时,不同温度所造成的发酵体系环境有所不同,对黄酮与总酚含量有影响,温度升高,分子渗透、扩散、溶解速度加快,使活性物质易于从果肉细胞转移到发酵液中[22]。由图4可知,实验通过感官品评以及参考黄酮、总酚含量,得出当发酵温度为15、20 ℃时,感官评分高,黄酮、总酚含量适中,但考虑到发酵周期,最后选择20 ℃进行发酵。

图4 发酵温度对仙人掌发酵酒发酵的影响

2.2 响应面试验结果

根据表1进行Box-Benhnken中心组合实验设计,共29个实验点,研究各因素对仙人掌发酵酒酒精度、总糖、黄酮、总酚、总酸和感官评价的影响。响应面试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Box-Benhnken experimental design and results

2.2.1 仙人掌发酵酒的主成分分析 采用SPSS 20.0对表3中仙人掌发酵酒指标酒精度、总糖、黄酮、总酚、总酸和感官评价进行主成分分析[23],主成分的特征值、贡献率和累积贡献率见表4,根据大于80%的累积贡献率,提取的三个主成分累积贡献率为80.361%,可以说明提取的三个主成分能够全面地反映仙人掌发酵酒的品质信息[24]。通过仙人掌发酵酒的指标特征向量绝对值,表5得到,决定第一主成分的指标主要是总酸、酒精度和总糖,第二主成分的指标主要是黄酮和总酚,第三主成分的指标主要是总酸和感官评价。

表4 仙人掌发酵酒中主成分的贡献率及特征值Table 4 Contribution rates and characteristic values and of principal components in cactus wine

由于各个指标间存在单位和变异程度的差异,因此对综合得分F进行规范化处理后得到规范化综合得分Z,再以Z作为响应值进行响应面分析,其结果如表6所示。

表6 主成分得分与规范化综合得分Table 6 Principal component scores and standardized score

2.2.2 规范化综合得分的响应面分析 利用Design-Expert 10.0软件对29个实验点和对应的规范化综合得分进行多元归拟合,得到回归模型方差分析见表7,各因素间的相互作用见图5,得到的回归模型方程如下:

表7 回归模型方差分析Table 7 Analysis variance of regression model

Z=0.83-0.12A-0.012B+0.084C+0.11D+0.065AB-0.085AC+0.011AD+0.0063BC+0.094BD+0.31CD-0.35A2-0.17B2-0.23C2-0.19D2

由表7回归模型方差分析可知,p<0.0001,该模型项显著性极高,并且该模型失拟项p>0.05,差异性不显著,表明模型建模成功。决定系数R2=0.9599大于0.9,说明该模型实际值与预测值拟合性较高,所以用此模型对实验数据进行分析和预测[25]。各因素中,一次项A、C、D为极显著,B不显著,交互项CD为极显著(p<0.01),AC、BD显著(p<0.05),AB、AD、BC不显著(p<0.01),二次项A2、B2、C2、D2均为极显著(p<0.05)。按照比较F值大小可知影响仙人掌发酵品质的因素顺序为:料水比(A)>发酵温度(D)>初始糖度(C)>酵母接种量(B)。

2.2.3 各因素交互分析 响应面能够直接反映各因素与响应值规范化综合得分之间的关系和各因素间的交互作用,响应面的陡峭程度反映了两个因素的交互作用影响的大小,响应面的坡度越陡,等高线密集形成椭圆则反映两因素的交互作用的影响越大,反之,两因素的交互作用影响不大。由图5可以看出,发酵温度与初始糖度的响应面坡度最陡峭,其等高线形成半椭圆,表明CD的交互作用极显著(p<0.01),表明对响应值规范化综合得分影响较大。料水比与初始糖度、酵母接种量与发酵温度的响应面较为陡峭,其等高线密集并形成椭圆,交互作用显著(p<0.05),表明对响应值规范化综合得分影响大。

图5 各因素间的交互作用

2.2.4 验证实验 根据响应面分析软件得出的最佳工艺条件参数为:料水比1∶4,酵母接种量0.05%,初始糖度24.65%,发酵温度18.89 ℃,在此条件下,规范化综合得分为0.916。通过对预测工艺优化确定条件进行调整初始糖度为25%、发酵温度为20 ℃酿造仙人掌发酵酒,最终得到仙人掌发酵酒酒精度为12.9%,黄酮含量为6.2 μg/mL,总糖为5.2 mg/mL,总酚为38.6 μg/mL,总酸为4.9 g/L,规范化综合得分为0.899,与预测的数值基本一致,因此该模型基本准确,表明响应面分析与主成分分析法相结合得到的仙人掌酒发酵工艺参数对仙人掌酒的生产具有指导意义。

2.3 仙人掌发酵酒质量指标

2.3.1 感官指标 外观色泽呈淡黄色、澄清透明,酒体协调、醇厚、柔和,风格独特,有典型的仙人掌风味。

2.3.2 理化指标 酒度12.9%、总糖5.2 mg/mL、黄酮含量为6.2 μg/mL、总酚为38.6 μg/mL、总酸为4.9 g/L。

2.3.3 微生物指标 符合GB 2758-2012所规定的要求。

3 结论

以仙人掌片为原料,进行发酵仙人掌酒,通过优化实验得出最佳发酵工艺条件为:料水比1∶4,酵母接种量0.05%,初始糖度25%,发酵温度20 ℃。在此条件下发酵的仙人掌酒酒精度为12.9%,黄酮含量为6.2 μg/mL,总酚为38.6 μg/mL。通过实验发现,仙人掌酒的发酵适合于相对较低一些的温度发酵,能够保持仙人掌的清香,还可以发挥酵母的代谢香气,获得的仙人掌酒酒体柔和、清香淡雅,具有典型的仙人掌特有的风味。仙人掌本身具有很好的营养价值和开发价值,本研究开发成仙人掌酒,既保留了仙人掌本身的功效,又增加了酵母菌的代谢产物,特别是在酒精的作用下使仙人掌的有效成分更加容易吸收。由于仙人掌的功效突出在国外主要作为蔬菜鲜食食用,但是国内还不是非常适应作为鲜食蔬菜食用,因此,开发仙人掌酒为今后大力推广仙人掌深加工提供了新的思路,对仙人掌酒的开发具有一定的指导意义。