高频突变外显子测序发现GJA8突变所致先天性白内障的家系分析

曹宗富 刘丽娟 喻浴飞 朱益华 童 绎 马 旭 阳菊华

1.国家卫生计生委科学技术研究所(北京，100081)；2.国家人类遗传资源中心；3.福建省福州东南眼科医院；4.福建医科大学附属第一医院；5.福建医科大学医药生物工程中心

先天性白内障是一组在出生或儿童早期发生的白内障[1]，是一种严重的出生缺陷，是世界儿童期可治疗性致盲的首要原因[2]。在精准医学时代，可以通过基因检测在植入前、孕期和出生后筛查先天性白内障致病突变，实现出生缺陷的三级预防和干预。先天性白内障具有明显的遗传异质性[3]。大量研究证实，先天性白内障致病基因包括α/β/γ晶体蛋白基因[4]、膜蛋白基因[5]、调节眼球发育的基因[6]、细胞骨架蛋白基因[7]等基因。本研究对一个常染色体显性的先天性白内障家系的先证者，利用Sanger测序技术对先天性白内障突变热点区域进行检测，对发现的变异位点在家系中进行验证，利用美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG)的解读规则对发现的变异进行致病性分级。

1 对象与方法

1.1 对象

高频外显子测序分析的血液样本取自福州东南眼科医院收治的先天性白内障患者及其家属。每个家庭成员都进行眼部裂隙灯检查与全身体格检查，以明确疾病表型与遗传模式。同时，选取112个正常人群作为阴性对照。每个研究个体均采集5ml静脉血。

本研究是遗传性眼病遗传筛查项目的一部分。相关的样本采集及实验流程均已通过福建医科大学伦理审查委员会审查。血样和临床资料的收集符合知情同意原则。

1.2 高频外显子的选择

使用计算机文本挖掘和人工检查相结合的方法，基于PubMed和CNKI，在基因、外显子(内含子)和变异水平上分别获得了先天性白内障突变谱，发现突变在各个外显子上分布是不均匀的，存在突变热点区域[8]。基于中国人群先天性白内障突变谱，挑选了18个基因的26个外显子作为突变热点区域，对先天性白内障家系进行突变筛查[9]。这18个基因包括：CRYAA,CRYAB,CRYBA1,CRYBA4,CRYBB1,CRYBB2,CRYBB3,CRYGC,CRYGD,CRYGS,GJA8,GJA3,HSF4,MIP,BFSP2,EPHA2,FYCO1和PITX3。

1.3 DNA提取和高频外显子测序

按照向导基因组DNA纯化工具包 (Promega,中国)的操作说明从全血中提取基因组DNA。对筛选的先天性白内障致病基因的26个外显子及其两侧的剪接序列进行PCR扩增。GJA8基因的PCR引物和条件见表1。扩增产物经纯化后，采用双脱氧末端终止法(Sanger法)进行测序反应，由ABI 全自动DNA测序仪3730XL进行序列分析。首先对先证者进行测序，如果先证者中筛查到可疑突变，然后在其他家系成员和112个正常对照中进行测序验证。

表1 GJA8基因的PCR扩增引物和条件

1.4 生物信息学分析

筛查到的突变按照HGVS进行命名，用VEP软件对变异进行注释，并和dbSNP150、1000g、ESP6500、gnomAD以及建立的先天性白内障基因变异数据库进行比对。对编码区新发的错义突变，进一步用PolyPhen2 软件和SIFT软件[10]进行功能预测，利用UCSC基因组浏览器对突变保守性进行分析。根据ACMG与美国分子病理协会(AMP)提出的单基因病变异临床显著性的分级标准和指南，对遗传变异进行致病性分级[11]。首先使用InterVar软件[12]进行自动化分级然后再行人工校正。遗传变异的分级包括：致病、可能致病、致病性不明、可能良性、良性。

2 结果

2.1 临床表现

该先天性白内障家系是由4个成员组成的二代家系，其中包括3个先天性白内障患者，先证者为3岁女性。系谱图(图1)显示该先天性白内障家系的遗传模式表现为常染色体显性遗传。该患者表现为左眼正常，右眼晶状体后囊膜中央区皮质灰白色混浊，边缘不整齐，临床诊断为后极性白内障。体格检查未发现其他系统性畸形，患者家属否认其他眼睛和系统性畸形的家族史，家系内其他患者表现为相似的白内障表型。

2.2 测序结果及分析

对该家系先证者的18个基因的26个外显子进行直接测序，发现了1号染色体上的GJA8基因的第2号外显子上569位的一个杂合变异位点(图2)，由腺嘌呤突变为鸟嘌呤(c.569A>G)，可导致其编码的蛋白质Cx50在第190位天冬酰胺变成丝氨酸(p.N190S)。该位点在dbSNP150、1000g、ESP6500、gnomAD数据库中均未见人群频率的报道，未收入HGMD数据库和已建立的先天性白内障数据库，是罕见的变异位点，SIFT软件预测为“有害”，PhlyPhen软件预测为“很可能有害”，保守性分析显示190位的天冬酰胺在人、猴、小鼠、狗、大象、负鼠、鸡、爪蟾以及斑马鱼的GJA8中都非常保守(图3)。该突变在家系中的对照个体和112个人群对照个体中没有检出。在该家系先证者中，其他筛查的17个基因的25个外显子中没有发现突变。该突变在家系患者中符合遗传共分离规律。

黑色箭头为先证者图1 先天性白内障家系图

黑色箭头指示变异位点所在的碱基图2 突变的Sanger测序图

图3 GJA8变异位点的保守性分析

2.3 变异的临床显著性分级

对发现的GJA8基因上的变异c.569A>G，根据ACMG与美国分子病理协会(AMP)提出的单基因病变异临床显著性的分级标准和指南，对遗传变异进行致病性分级。该研究是基于先天性白内障的突变热点区域进行测序，变异位点位于突变热点区域，因此该位点满足PM1标准。该变异位点在dbSNP150、1000g、ESP6500、gnomAD等公共数据库的对照人群中没有发现，因此该变异位点满足PM2标准。该变异位点在家系中多个先天性白内障患者中符合遗传共分离规律，因此变异位点满足PP1标准。Sift、Polyphen2和保守性分析等多种生物信息学方法都预测为有害突变，因此该变异位点满足PP3标准。其中，InterVar软件自动判别该位点满足PM1、PM2和PP3标准，PP1标准为人工校正。基于InterVar并参考ACMG变异解读规则，判断该变异位点为“可能致病”位点。

根据以上分析，先证者和同胞弟弟的c.569A>G (p.N190S)位点均来自于父亲，符合常染色体显性遗传分离规律(图1)。该位点在所有已知的数据库中没有记录，属于极罕见的变异。文献尚没有报道过，系首次报道。由此判定，GJA8基因的c.569A>G (p.N190S)的杂合变异为该先天性白内障家系的可能致病性变异位点。

3 讨论

先天性白内障存在较强的遗传异质性，文献报道的相关基因有30个以上，但前期研究发现，先天性白内障在外显子水平存在突变热点区域[8]。该研究尝试基于高频突变外显子区域直接测序，并按照ACMG的解读规则[12]对变异位点进行解读，最终在已知的致病基因GJA8中成功筛选到了候选的致病变异位点，c.569A>G (p.N190S)是未经报道的新致病变异位点。蛋白质保守性分析显示该氨基酸位点在不同物种间高度保守，提示该位点的氨基酸改变可能对蛋白功能有重要影响。经对家系内其他成员进行直接测序验证，表明GJA8的c.569A>G (p.N190S)杂合变异符合遗传共分离的规律，为该患者的可能致病性变异位点。

GJA8基因编码跨膜连接蛋白Cx50，对于晶状体生长和晶状体纤维细胞的成熟是必需的[13]。Cx50是晶状体的连接蛋白，缝隙连接保持离子和水平衡以及晶状体的透明度和光学性质。缝隙连接由2个相互作用的半通道组成，这些半通道在相邻的细胞之间形成连通通道。每个半通道含有6个连接蛋白亚基。Cx50是缝隙连接通道蛋白的组分之一，并且以钙和pH依赖性方式发挥作用[14]。该基因的突变与先天性全白内障[15]、核性白内障[16]、带状核粉性内障[17]、后极性白内障[18]和白内障-小角膜综合征[19]有关。GJA8突变可能通过引起Cx50的过表达，从而促使白内障的发生[20]。

该研究再次证明，利用Sanger测序技术对先天性白内障突变热点区域进行直接检测是可行的。该方法与新一代测序技术相比，成本更低，也更加快速。同时，该方法也具备发现疾病相关的已报道基因上新变异位点的能力。基于突变热点区域进行直接检测的方法的一个缺点是，对于未知基因上突变引起的单基因病不能够检出。因此，对于高频外显子区域Sanger直接测序方法初筛未检出病例，应选择使用新一代测序进行全外显子组筛查，以进一步提高检出率。

本文采用高频外显子组直接测序技术，检测到了先天性白内障家系中GJA8基因的一个杂合变异c.569A>G (p.N190S)，此位点是新发现的变异位点。这一研究结果不仅拓宽了先天性白内障GJA8基因的突变谱，也为将来先天性白内障可能进行的产前诊断、孕早期诊断、新生儿出生缺陷早期筛查和预防干预提供了分子基础。