响应面优化小麦淀粉抗老化酶解工艺

王柱，史腾轩，王思宇，亓鑫，董墨思，冀迎昕，刘垚彤，李苏红

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

世界上每年都会出现因为淀粉老化而浪费大量粮食的现象，因此研究淀粉老化问题显得尤为迫切[1-2]。淀粉老化是其线性分子通过氢键重新组合生成不溶的沉淀物[3]。目前抑制淀粉老化多采用添加糖类[4-5]、乳化剂[6-7]、亲水胶体[8-9]及酶水解法[10-11]来减缓淀粉老化问题，其中酶解作用效果显著且绿色无污染，备受淀粉抗老化研究者的关注。姬娜等[12]发现G4淀粉酶能作用于淀粉支链产生四糖，以此降低支链淀粉侧链的长度延缓老化；孙玲玲等[13]、邱泼等[14]采用β-淀粉酶对糯米回生、米粉老化现象进行研究，β-淀粉酶作为一种端切酶，从淀粉分子的非还原末端依次切下麦芽糖分子，从而缩短支链淀粉的外链长度抑制淀粉回生；此外，王辛等[15]利用α-淀粉对传统糕团类淀粉老化进行研究。本研究拟通过冻融稳定性、膨胀度和溶解度比较分析β-淀粉酶和G4淀粉酶对小麦淀粉老化特性影响的差异及二者之间是否存在协同作用，结果表明两者都对淀粉老化有一定的抑制作用，但两者对淀粉老化的影响无显著差异，且两者的协同效果不显著。从实际生产的角度选择价格低廉的β-淀粉酶酶解小麦淀粉的条件进行响应面法优化，以期为酶解法在淀粉抗老化领域的应用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦淀粉：南京甘汁园糖业有限公司；β-淀粉酶（70万U/mL）：浙江仁和生物科技有限公司；G4淀粉酶（20万U/mL）：河南庆飞食品配料有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9070S电热鼓风干燥机：宁波乐电仪器制造有限公司；JD100-4电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；TDL-5离心机：上海安亭科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

称取80 g小麦淀粉，与220 mL蒸馏水在烧杯中用玻璃棒搅均，放入58℃的水浴锅糊化20 min，冷却至室温25℃，向其中加入淀粉酶，放在40℃的水浴锅水浴30 min，不停地搅拌使酶充分反应，反应完全后在100℃下灭酶2.5 min，温度降至室温25℃。将样品倒入500 mL离心瓶，于3 000 r/min离心20 min[16]，取下层湿淀粉匀称地涂抹在锡纸上，然后将涂有样品的锡纸置于60℃干燥箱干燥12 h，将干燥后的样品与锡纸分离，研磨，制备得到样品。

1.3.2 冻融稳定性测定

小麦淀粉与蒸馏水混合配成浓度6%的乳液，100℃水浴20 min，温度降至室温25℃；将小麦淀粉放入容量10 mL的离心管中，放于-18℃冷冻24 h，然后室温25℃下融化8 h。于3 000 r/min离心20 min，将上清液与沉淀物分离，计算沉淀物的重量，计算析水率。平行测定3次。析水率计算公式如下：

式中：D 为析水率，%；A1为淀粉糊质量，g；A2为沉淀物质量，g。

1.3.3 溶解度、膨胀度测定

将小麦淀粉与蒸馏水混合配成浓度6%的乳液，于85℃水浴锅中反应30 min，然后于3 000 r/min的条件下离心20 min，膨胀淀粉为淀粉糊的下部，随即将上层的清澈的液体与淀粉糊分离开来，然后干燥，便得到水溶淀粉，然后利用水溶液淀粉的质量计算出溶解度。溶解度、膨胀度计算公式如下：

式中：S为溶解度，%；E为膨胀度，%；A1为水溶淀粉质量，g；A2为淀粉样品质量，g；A3为膨胀淀粉质量，g。

1.4 单因素试验

1.4.1 酶解时间对小麦淀粉抗老化的影响

按1.3.1的方法对小麦淀粉进行糊化，然后加入0.2%的淀粉酶，分别在 60 ℃水解 5、15、25、35、45、55 min后，沸水浴灭酶2.5 min。离心20 min、干燥后测定样品的冻融稳定性、溶解度和膨胀度的变化。

1.4.2 酶解温度对小麦淀粉抗老化的影响

按上1.3.1的方法对小麦淀粉进行糊化，然后加入0.2%的淀粉酶，分别在 40、45、50、55、60、65 ℃ 酶解30 min后，沸水浴灭酶2.5 min。离心20 min、干燥后测定样品的冻融稳定性、溶解度和膨胀度的变化。

1.4.3 加酶量对小麦淀粉抗老化的影响

按1.3.1的方法对小麦淀粉进行糊化，然后分别加入0.05%、0.10%、0.20%、0.25%、0.30%的淀粉酶，60℃水解30 min。离心20 min、干燥后测定样品的冻融稳定性、溶解度和膨胀度的变化。

1.5 复配试验

称取80 g小麦淀粉，与220 mL蒸馏水在烧杯中用玻璃棒搅均，放入58℃的水浴锅糊化20 min，冷却至室温25℃。然后向其中加淀粉酶，ck1为只添加了0.15%的β-淀粉酶，ck2为只添加了0.2%的G4淀粉酶，其他组是在添加了0.15%β-淀粉酶的基础上分别添加0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%的 G4淀粉酶，放在60℃水浴锅反应35 min，样品处理方式同1.3.1。

1.6 响应面优化酶解淀粉抗老化工艺

使用Design-Expert 8.0软件，采用Box-Behnken设计，自变量分别是加酶量、时间、酶解温度，A、B、C分别表示加酶量、时间、酶解温度，自变量的高、中、低水平分别用1、0、-1表示，分别以小麦淀粉的析水率、溶解度和膨胀度为响应值，进行响应面试验。试验因素与因素水平见表1。

表1 试验因素与因素水平Table 1 Experimental factors and factors level

1.7 数据处理

数据处理采用Microsoft Excel 2013，显著性分析采用SPSS16.0，响应面优化采用Design Expert8.0。

2 结果与分析

2.1 酶解时间对小麦淀粉抗老化的影响

淀粉颗粒吸水膨胀，溶解度和膨胀度的升高，氢键强度减弱，抑制分子之间相互吸引，延缓淀粉重结晶。析水率能够反映淀粉的冻融稳定性，冻融后析水率越低说明抑制淀粉老化的效果越明显。G4淀粉酶和β-淀粉酶处理小麦淀粉随时间的变化如图1。

图1 酶解时间对小麦淀粉抗老化的影响Fig.1 The effect of enzymatic hydrolysis time on the inhibiting retrogradation of wheat starch

G4淀粉酶在酶解时间为45 min时，溶解度和膨胀度最高分别为16.2%和64.4%，而析水率最低为55.7%。β-淀粉酶在酶解时间为35 min时，溶解度和最高分别为16.1%，而析水率最低55%。酶解时间在35 min～45 min以前，随着酶解时间的增加，淀粉的溶解度和膨胀度增加，析水率下降。一旦酶解时间超过35 min～45min时随着时间的继续增加淀粉的溶解度和膨胀度都有明显的下降趋势，而析水率升高。β-淀粉酶在55 min时的析水率略低于45 min，但仍高于35 min时。这是因为随时间的延长，酶对淀粉老化的抑制效果趋于完全，抑制淀粉老化的效果不明显[17]。

通过对比可知，G4淀粉酶处理后的小麦淀粉的溶解度和膨胀度比原小麦淀粉分别上升了9.45%和22.2%，析水率下降了12.7%。β-淀粉酶处理后的小麦淀粉的溶解度和膨胀度比原小麦淀粉分别上升了9.3%和30.5%，析水率下降了13.4%。与空白组比较，结果进行显著性分析，酶解时间对小麦淀粉的抗老化效果具有极显著影响（P＜0.01），且两种酶的作用效果无显著差异段，从单因素的试验结果来看，在酶解时间25 min～35 min时，两种酶的抗老化效果趋势最好，一旦超过这一时间抗老化的效果变差，因此选择30 min作为最优条件。

2.2 酶解温度对小麦淀粉抗老化的影响

酶解温度对小麦淀粉抗老化的影响见图2。

图2 酶解温度对小麦淀粉抗老化的影响Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on inhibiting retrogradation of wheat starch

由图2可知，酶解温度逐渐达到淀粉酶作用效果最佳时的温度，此时淀粉抗老化效果最好，淀粉的溶解度和膨胀度都达到顶峰，析水率达到最低值。G4淀粉酶在酶解温度60℃时，溶解度和膨胀度最高分别为14.2%和64.4%，而析水率最低为50%。β-淀粉酶在酶解温度为55℃时，溶解度和膨胀度最高分别为13.25%和53.3%，而析水率最低为45.1%。但超过50℃，酶的活力降低或部分丧失，淀粉的溶解度和膨胀度下降，析水率升高。

通过对比可知G4淀粉酶处理后的小麦淀粉的溶解度和膨胀度比原小麦淀粉分别上升了7.4%和22.2%，析水率下降了18.4%。β-淀粉酶处理后的小麦淀粉的溶解度和膨胀度比原小麦淀粉分别上升了6.4%和11.1%，析水率下降了23.3%。结果进行显著性分析，酶解温度对小麦淀粉的抗老化效果具有极显著影响（P＜0.01），且两种酶的作用效果无显著差异。酶解温度在50℃～55℃时，淀粉酶抗老化效果最优，一旦超过这一温度抗老化效果变差，因此选择52.5℃作为最优条件。

2.3 加酶量对小麦淀粉抗老化的影响

加酶量对小麦淀粉抗老化的影响见图3。

图3 加酶量对小麦淀粉抗老化的影响Fig.3 The effect of enzyme dosage on inhibiting retrogradation of wheat starch

图3表明，G4淀粉酶在加酶量为0.2%时，β-淀粉酶在添加量为0.15%时，溶解度和膨胀度最高均为12.7%和53.3%，且析水率最低。经过G4淀粉酶酶解后小麦淀粉的析水率降到37.9%，其结果与姬娜等[12]的研究结果一致。β-淀粉酶处理的析水率则为57.4%。伴随着加酶量的逐渐增多，酶解程度增大达到顶峰，之后趋于水平。加酶量在0.1%～0.15%时，抗老化效果最好，一旦超过这一添加量抗老化效果变差，因此选择加酶量为0.13%作为最优条件。

通过对比可知G4淀粉酶和β-淀粉酶处理后的小麦淀粉的溶解度和膨胀度都比原小麦淀粉分别上升5.9%和11.1%。G4淀粉酶处理的析水率下降了30.5%，β-淀粉酶处理的析水率下降了11%。结果进行显著性分析，加酶量对小麦淀粉的抗老化效果具有极显著影响（P＜0.01），且两种酶的作用效果无显著差异。

2.4 复配试验的方差分析

G4淀粉酶与β-淀粉酶复配试验的显著性分析结果见图4。

图4 G4淀粉酶与β-淀粉酶复配Fig.4 Complex of G4 amylase and β-amylase

将其他试验组、ck2组与ck1组进行显著性分析，只有析水率一个指标显著，且两者复配作用的效果不显著，从实际生产的角度，选择价格低廉的β-淀粉酶进行响应面优化试验。

2.5 响应面优化

由单因素试验结果分析可知影响小麦淀粉酶解的因素主要有3个：加酶量、酶解时间、酶解温度，试验采用三因素三水平响应面法优化β-淀粉酶酶解小麦淀粉工艺参数，试验设计与结果如表2所示。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Experimental scheme and results of response surface

析水率结果的方差分析：使用二次模型拟合各因素与析水率的关系，模型的P＜0.000 1，说明这个试验模型极显著。失拟项P=0.071 0＞0.05，表明结果不显著，但是该方程对试验的拟合程度好，该试验方案可行。析水率受因素 A2、B2、C2的作用极明显（P＜0.01）。析水率受因素AB、BC、AC的交互作用后的结果不明显。根据一次回归方程系数的绝对值比较可得，对析水率影响因素的主次为：酶解时间＞加酶量＞酶解温度，回归方程见表3。

溶解度结果的方差分析：使用二次模型拟合各因素与溶解度的关系，模型的P＜0.001，证明这个试验模型极显著。失拟项P=0.584 1＞0.05，不显著，表明该方程对试验的拟合度好，该方案可行。溶解度受因素A2、C2的作用均极明显（P＜0.01）；溶解度受B2的作用明显（P＜0.05）。溶解度受因素AB、BC、AC交互作用后的结果不明显。根据一次回归方程系数的绝对值比较可得，影响溶解度因素的主次为：酶解时间＞加酶量＞酶解温度，回归方程见表3。

膨胀度结果的方差分析：使用二次模型拟合各因素与膨胀度的关系，模型的P＜0.05，说明这个试验模型显著。失拟项P=0.058 5＞0.05，不显著，说明该方程对试验的拟合度好，该方案可行。因素A2、B2对膨胀度的作用明显（P＜0.05）；C2对膨胀度的作用不明显。膨胀度受因素AB、BC、AC交互作用后的结果不显著。根据一次回归方程系数的绝对值比较可得，影响膨胀度因素的主次为：酶解时间＞加酶量＞酶解温度，回归方程见表3。

表3 响应值对因素的回归方程Table 3 Regression equation of response value pairs

2.5.1 各因素交互作用对析水率的影响

各因素交互作用对析水率的影响见图5。

由图5a可知，酶解时间和加酶量的逐渐增加，小麦淀粉的析水率先降低后升高，等高线的形状趋近于圆形，析水率受时间和加酶量的交互作用后变化不明显。由图5b可知，加酶量和温度的逐渐升高，析水率先降低然后有明显的增加，等高线的形状为椭圆形，这表明析水率受加酶量和温度的作用显著，由此可见，选择合适的加酶量和温度有利于淀粉的抗老化。同理，由图5c可知，析水率受酶解时间与温度的交互效应后效果显著。

图5 各因素交互作用对析水率的影响Fig.5 Influence of each factor interaction on the syneresis rate

2.5.2 各因素交互作用对膨胀度的影响

各因素交互作用对膨胀度的影响见图6。

图6 各因素交互作用对膨胀度的影响Fig.6 Influence of each factor interaction on the expansion degree

由图6a可知，酶解时间和加酶量的逐渐增加，小麦淀粉的膨胀度先急速升高再匀速下降，等高线的形状趋近于椭圆形，膨胀度受时间和加酶量的交互效应后变化显著。由图6b可知，加酶量和温度的逐渐升高，膨胀度先急速上升再缓慢下降，等高线的形状为椭圆形，说明膨胀度受加酶量和温度交互效应后的变化极显著。由图6c可知，酶解温度和时间的逐渐延长，膨胀度匀速上升然后匀速下降，说明膨胀度受酶解温度和时间的交互效应后的变化极显著。

2.5.3 各因素交互作用对溶解度的影响

各因素交互作用对溶解度的影响见图7。

图7 各因素交互作用对溶解度的影响Fig.7 Influence of each factor interaction on the solubility

由图7a可知，随酶解时间和加酶量的逐渐增加，小麦淀粉的溶解度先上升然后缓慢的下降，等高线的形状趋近于椭圆形，说明溶解度受时间和加酶量的交互效应后的变化显著。由图7b可知，加酶量和温度的逐渐升高，溶解度急速上升然后下降，等高线的形状为椭圆形，说明溶解度受加酶量和温度的交互效应后的变化显著。同理，由图7c可知，酶解时间和温度的作用也显著。

2.6 优化及验证试验

用Design Expert 8.0软件进行响应面优化，得到小麦淀粉酶解的最优工艺条件是：加酶量0.13%、酶解时间31.59 min、温度52.84℃，在此条件下，小麦淀粉的析水率35.83%、膨胀度66.66%、溶解度17.31%。考虑到实际生产，小麦淀粉酶解的最优工艺条件调整为：加酶量0.13%、酶解温度52.5℃、酶解时间30 min，在这个条件下，小麦淀粉的析水率、膨胀度和溶解度分别为35.8%、66.65%、17.34%，与预测值相近，由此表明该模型可靠。

3 结论

本研究比较分析了β-淀粉酶、G4淀粉酶的酶解作用对小麦淀粉抗老化的影响，两种酶对小麦淀粉的抗老化指标析水率、溶解度和膨胀度的影响均具有显著性，能够显著提高淀粉的抗老化效果，两者的作用效果相近无显著差异，且复配后协同效果不显著。选用具有价格优势的β-淀粉酶得到小麦淀粉酶解的优化工艺条件是：加酶量0.13%、酶解温度52.5℃、酶解时间30 min，在此条件下，小麦淀粉的析水率、膨胀度和溶解度分别为35.80%、66.65%、17.34%，显著改善了小麦淀粉的冻融稳定性及膨润性，延缓其老化进程。