酸木瓜总黄酮提取工艺的优化

常娅妮，王亚岚，李玲

（天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384）

酸木瓜（Chaenomeles sinensis）是一种古老的水果树上结出的果子，属于被子植物门双子叶植物纲蔷薇科木瓜属，也被称作木梨或者光皮木瓜，是云南特产，特别是在大理栽植广泛，是集药用、食用和观赏为一体的果实，有一种特殊的香味，色泽金黄，营养极其丰富。酸木瓜中的主要元素都是有益于人体的，如酸木瓜中特有的木瓜蛋白酶，它能将脂肪转化为脂肪酸，可以促进脂肪的消化和吸收，也可以帮助脾脏消化，酸木瓜中特有的木瓜生物碱也具有抗菌和抵制肿瘤的作用[1]。酸木瓜中还含有具有保护肝脏、抵抗炎症、抑制细菌、降低血脂、预防肝硬化、抗衰老、软化血管等功能[2]的齐墩果酸。酸木瓜还可以制作成为果酒、泡酒[3-4]、果脯[5]、木瓜牛奶、木瓜饮料[6-7]等，同时也能用来制作美味佳肴，在大理地区用酸木瓜做成的酸木瓜鸡、酸木瓜鱼等，滋味非常可口。酸木瓜也是一种可以健脾、开胃、舒通筋骨、祛风寒除湿气、减轻疼痛，医治和防止风湿病和缺乏维生素C症的药物。黄酮类物质广泛的存在于生物体中，它拥有较强的生物活性和药物活性，许多研究表明，酸木瓜中的黄酮类物质具有较强的抗氧化作用和增强血管弹性、降血压、预防心律失常等效用[8]。近年来随着人们生活水平的提高，饮食健康问题日益被大家看重，尤其富含各种抗氧化成分的食物更是备受青睐，它们的保健药用价值与其所含的抗氧化成分关系密不可分，所以以天然食材为原料开发各种食品级抗氧化剂等保健产品势在必行[9-14]。

超声波在液体中具有空化效应、机械效应和热效应，这些效应可以加快植物中有效成分的溶出，从而加速植物活性组分的提取[15]，超声波乙醇辅助法能够更加高效、便捷和低污染的提取植物中的活性成分。目前利用超声波从植物中提取精油[16]、皂素[17]、蛋白质[18]、黄酮类等活性物质的研究较多，但是以酸木瓜为原料利用超声波提取黄酮类物质的研究较少，且没有从酸木瓜果皮、果肉和籽中分别提取黄酮类物质的研究。因而本文分别以酸木瓜的果皮、果肉、籽为原料，选取超声波的超声功率、提取时间、料液比和乙醇体积分数4个因素，考察酸木瓜不同部位的总黄酮含量差异情况，并选取总黄酮含量较多的部位进行正交试验，得到在酸木瓜中提取总黄酮的最优工艺条件，为酸木瓜中黄酮类物质的高效提取和酸木瓜果皮、果肉和籽的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸木瓜：产自云南大理，选取大小适中的新鲜青果，果重约为250g/个，4℃冷藏备用；芦丁标准品：北京百灵科技有限公司；95%乙醇、无水乙醇、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2（分析纯）：天津康科德有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-3200S紫外分光光度计：上海美普达仪器有限公司；SorvallTM ST16高速离心机：德国Thermo Fisher Scientific公司；JRA-650T超声波提取机：无锡杰瑞安仪器设备有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；WF-B高速万能粉碎机：科威机械（上海）有限公司；DHG-9145A电热鼓风干燥箱、BPZ-6120-2B真空干燥箱：上海恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品配制

参照了马文兵等[19]的方法和2010年版《中华人民共和国药典》[20]，精准称取0.024 7 g芦丁标准品，在105℃下利用真空干燥箱干燥4 h至重量稳定不变，再溶解于适量的70%乙醇中，为了使其充分溶解，可以转至超声波清洗器中适当超声，待完全溶解后再转至100 mL容量瓶中并定容至刻度，得到的标准品浓度为0.247（mg/mL）。

1.3.2 酸木瓜中总黄酮的提取工艺

酸木瓜样品洗净，切碎后，将新鲜的酸木瓜肉、皮、籽放在鼓风干燥箱内50℃下烘干至恒重，用高速粉碎机分别粉碎酸木瓜果肉、果皮、籽，60目过筛备用。精确称取酸木瓜果皮、籽各1 g和酸木瓜果肉2 g放置于容量为50 mL的锥形瓶中，在不同条件下超声取提，将获得的提取物进行离心、降压抽取过滤，收集滤液。为了充分提取酸木瓜的总黄酮成分，应重复操作两次，合并滤液静置后，取上清液备用，使用70%的乙醇溶液定容，即得到酸木瓜果皮、果肉和籽的样液。

1.3.3 测定方法

利用黄酮类物质在Al（NO3）3与亚硝酸盐的作用下产生络合物，且在碱性环境中显色的特性，采用NaNO2-Al（NO3）3显色法[21]，选择吸收峰较大的510 nm处波长[22]，用芦丁标准品配制标准曲线，酸木瓜样液显色完毕后，在510 nm波长下测其吸光度值，由标准曲线计算其总黄酮的质量浓度，并计算其总黄酮得率：

式中：C为酸木瓜提取液的浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为最初的定容容积，mL；m为酸木瓜的干粉质量，g。

重复操作3次取平均值。

1.3.4 单因素试验的设计

影响超声波乙醇辅助法提取酸木瓜中总黄酮的主要因素有乙醇体积分数、超声时间、料液比、超声功率等，因此，在固定超声温度60℃的条件下，以提取出的目标物得率为指标，分别对这4种影响因素进行单因素试验，考察各因素及水平对酸木瓜果皮、果肉和籽的总黄酮得率的影响。

1.3.4.1 料液比对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率影响的设计

准确称取处理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），分别按酸木瓜与乙醇溶液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）加入体积分数为 60%的乙醇溶液，在超声功率198 W的条件下超声30 min提取酸木瓜中的总黄酮，考察料液比对酸木瓜中总黄酮得率的影响。

1.3.4.2 乙醇体积分数对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率影响的设计

准确称取处理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜与乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例分别加入体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在超声功率198 W的条件下超声30 min提取酸木瓜中的总黄酮，考察乙醇体积分数对酸木瓜中总黄酮得率的影响。

1.3.4.3 超声波提取功率对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率影响的设计

准确称取处理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜与乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例加入体积分数为60%的乙醇溶液，分别在超声功率132、165、198、231、264 W 的条件下超声 30 min 提取酸木瓜中的总黄酮，考察超声功率对酸木瓜中总黄酮得率的影响。

1.3.4.4 超声波提取时间对酸木瓜果皮、果肉和籽中总黄酮得率影响的设计

准确称取处理好的1 g酸木瓜（果皮或籽）或2 g（果肉），按酸木瓜与乙醇溶液1∶25（g/mL）的比例加入体积分数为60%的乙醇溶液，在超声功率198 W的条件下分别超声提取 10、20、30、40、50 min，考察超声时间对酸木瓜中总黄酮得率的影响。

1.3.5 正交试验设计

选择总黄酮得率较高的酸木瓜部位，在单因素试验的基础上，筛选出各因素3个较好的水平，进行L9（34）正交试验，进一步去考察这4个因素，以期得到最优的提取工艺条件，因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

在最大吸收波长510 nm下，确定以不同浓度芦丁标准品的吸光度值A510为纵坐标，以芦丁标准品浓度x（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为A=10.509x+0.011 1（R2=0.999 3），见图 1。

表1 L9（34）正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.2 料液比对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率的影响

料液比对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率的影响见图2。

图2 料液比对酸木瓜中总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of solid liquid ratio on total flavonoids yield in sour papaya

由图2可以看出总黄酮得率在酸木瓜与乙醇溶液混合比为 1 ∶10（g/mL）～1 ∶25（g/mL）时，随着乙醇溶液所占比例的的增大总黄酮得率也增加，当酸木瓜与乙醇溶液的比例增至1∶25（g/mL）时，总黄酮得率达到最高，此时酸木瓜果皮中总黄酮得率为6.42%，果肉中总黄酮得率为4.71%，籽中总黄酮得率为2.87%，当乙醇溶液所占的比例继续增大时总黄酮得率均下降。田勇等[23]从昆仑胎菊中提取黄酮类物质时也遇到类似的情况，这可能是因为随着乙醇添加量的增加，很多其它可以溶于乙醇的物质大部分溶出，阻碍了酸木瓜中总黄酮的溶出，而且溶剂使用量的适度增加有利于酸木瓜中总黄酮的溶解，但是溶剂使用量过大会不利于后期提取液的降压抽滤提纯[24]，从而导致酸木瓜中总黄酮得率降低，因此提取酸木瓜果皮、果肉和籽中总黄酮的最佳料液比是1∶25（g/mL）。

2.3 乙醇的体积分数对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率的影响

乙醇的体积分数对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率的影响见图3。

图3 乙醇体积分数对酸木瓜中总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of alcohol volume fraction on total flavonoids yield in sour papaya

随着乙醇体积分数的逐渐增加，酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率也逐渐增加。如图3所示，当乙醇体积分数为60%时，酸木瓜果皮、果肉和籽中总黄酮得率均达到最大，此时果皮中总黄酮得率为7.03%，果肉中总黄酮得率为5.16%，籽中总黄酮得率为3.49%，而当乙醇的体积分数超过60%时，酸木瓜中的总黄酮得率均下降。这一方面是由于黄酮类物质是极性化合物，当乙醇溶液浓度较小时，极性较大，这样黄酮类物质就会较易溶于乙醇溶剂里，而当乙醇体积分数过大时，其极性减弱，从而与黄酮类物质的极性相近程度降低，因此减少了酸木瓜中总黄酮的溶出[25]。另一方面是因为随着乙醇体积分数的增加，酸木瓜中一些易溶于乙醇的脂溶性物质、糖类物质、色素等副产物流出，这些副产物会与提取液体系合并，阻碍黄酮类化合物从酸木瓜中溶出，使得总黄酮得率下降，在一些报道中从其他原材料中提取黄酮类物质也有同类现象[26]，因此提取酸木瓜中总黄酮的最佳乙醇体积分数是60%。

2.4 超声波的提取功率对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率的影响

超声波的提取功率对酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率的影响见图4。

图4 超声功率对酸木瓜中总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield in sour papaya

由图4可知，酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮得率均随着超声波提取功率的增加呈先升后降的趋势，这种趋势在其他文献中也均有出现[27]，当超声功率为198 W时，酸木瓜果皮、果肉和籽中总黄酮得率均达到最大，此时酸木瓜果皮中总黄酮得率为7.22%，酸木瓜果肉中总黄酮得率为6.07%，酸木瓜籽中总黄酮得率为3.93%，当超声波提取功率超过198 W时，总黄酮得率均下降，这可能是由于随着超声波功率变大，超声波的辐射压强产生的扰动效应、破碎和混合搅拌作用、空化作用等多级效应变得更加强烈，从而分子的运动速度和频率就会变得更快，溶剂的穿透能力变得更强，加强了黄酮类物质的溶出[28]，但是当超声波提取功率达到一定范围时，因为超声波产生的能量较大，导致物料内部的组织结构崩溃，造成了超声波的扰动、空化等效应变小[29]，因而随着超声波功率逐渐升高，酸木瓜中总黄酮的得率逐渐降低，所以超声波提取功率198 W是提取酸木瓜中总黄酮的最佳提取功率。

2.5 超声波提取时间对酸木瓜果皮、果肉和籽中总黄酮得率的影响

超声波提取时间对酸木瓜果皮、果肉和籽中总黄酮得率的影响见图5。

图5 超声时间对酸木瓜中总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on total flavonoid yield in sour papaya

如图5所示，在超声提取时间达到30 min时，总黄酮得率达到最大，此时酸木瓜果皮、果肉、籽中的总黄酮得率分别为7.2%、3.64%、3.53%，当超声时间继续增大时，总黄酮得率均下降。这可能是由于超声时间在10 min～30 min范围内时，提取时间过短，黄酮类物质还没有被全部提取出来，从而黄酮得率随着提取时间的增加而上升，但是随着提取时间的增加，酸木瓜中的总黄酮有一部分被分解或氧化，导致了目标产物总黄酮的得率降低[30]。除此之外长时间的超声会使得总黄酮得率向极值靠近，同时也会使提取物中杂质的含量增加，目标物含量反而也会降低[31]，因此超声波提取时间30 min是酸木瓜中总黄酮的最佳提取时间。

2.6 提取酸木瓜果皮中总黄酮的正交试验结果分析

通过单因素试验发现不同提取条件下酸木瓜果皮中的总黄酮得率均高于果肉和籽中的总黄酮得率，所以选择酸木瓜果皮进行L9（34）正交试验，目的是为了进一步去探究超声时间、超声功率、料液比和乙醇的体积分数对酸木瓜果皮中总黄酮得率的影响，确定最佳提取工艺条件，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2可知影响酸木瓜果皮中总黄酮得率的因素顺序为：超声时间＞液料比＞超声功率＞乙醇的体积分数，提取酸木瓜果皮中总黄酮的最优工艺组合为A2B2C3D1，即超声时间为25 min，超声功率为231 W，料液比为1∶25（g/mL），乙醇体积分数为60%。由表3可知超声时间对酸木瓜果皮中总黄酮得率影响显著。为了确保试验的准确性，用正交试验得到的最佳提取工艺条件进行5次验证试验，验证试验得到酸木瓜皮中总黄酮得率为（7.31±0.38）%，表明试验结果重复性、稳定性均较好，因此该提取工艺条件合理。

3 结论

采用超声波乙醇辅助法提取酸木瓜果皮、果肉和籽中的总黄酮，得到较好的提取效果，经过单因素试验可知，酸木瓜果皮、果肉、籽的总黄酮得率依次为：酸木瓜果皮＞酸木瓜果肉＞酸木瓜籽，说明酸木瓜中的总黄酮主要存在于果皮部位，所以选择酸木瓜果皮进行正交试验。正交试验结果表明不同提取因素对酸木瓜果皮中总黄酮得率的影响顺序为：超声时间＞液料比＞超声功率＞乙醇体积分数，最优提取条件为：超声时间25 min，超声功率 231 W，料液比 1 ∶25（g/mL），乙醇的体积分数60%，在此提取条件下，酸木瓜果皮中的总黄酮得率可以达到（7.31±0.38）%。