小儿牛黄清心散遗传毒性研究

曲见松，祝清芬，赵 岩，孙昌华，赵艳霞，杜新磊，高 峰，张国印

（1.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；2.山东广育堂国药有限公司，山东 济宁 272000）

小儿牛黄清心散主要由天麻、胆南星、黄连等十四味中药配伍而成，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第2册，为临床较为常用的药物，具有清热化痰、镇静止痉的功效，对小儿支气管肺炎、上呼吸道感染、热性惊厥、小儿季节性流感和疱疹性咽峡炎等疾病具有较好的疗效[1-5]。目前国内外对中药安全性的评价研究日益引起关注，对于常用的组方药物的功效也逐步使用试验动物进行深入研究[6-10]。经查阅文献发现，目前国内外对小儿牛黄清心散是否具有遗传毒性的研究尚未见报道。考虑到小儿牛黄清心散使用对象的特殊性，有必要对其遗传毒性进行评价。本文采用遗传毒性标准组合试验对小儿牛黄清心散的遗传毒性进行了研究[11-12]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BP 211D电子天平（德国Sartorius公司）；高压蒸汽灭菌器（日本SANYO公司）；隔水式恒温培养箱（上海一恒）；Stuart温控摇床培养箱（英国Stuart公司）；BSC-1100A2生物安全柜（北京中联哈尔仪器公司）；INC153二氧化碳培养箱（德国Memmert公司）；LEICA DMIL倒置显微镜（德国徕卡公司）。

1.2 试剂

小儿牛黄清心散（山东方健制药）；肝微粒体酶S9（上海宝录）；敌克松（Chem Service公司）；注射用丝裂霉素（浙江海正药业）；2-氨基芴（上海晶纯试剂公司）；1, 8-二羟基蒽醌（Sigma-Aldrich公司）；环磷酰胺（Sigma-Aldrich公司）；DMEM培养液（Hyclone公司）；胎牛血清（浙江天杭）；胰蛋白酶（赛默飞世尔）；Giemsa染料（Salarbio公司）；甲醇（天津康科德）；灭菌注射用水（华仁药业）。

1.3 试验系统

1.3.1 菌株 鼠伤寒沙门氏菌株TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535（上海宝录）。

1.3.2 细胞株 中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL，中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库）。

1.3.3 动物 ICR小鼠，SPF级，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK（鲁）20140007。实验在山东省食品药品检验研究院屏障环境内进行，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）20130012。

2 方法

2.1 Ames试验

TA97a，TA98，TA100，TA102，TA1535 5种菌株经鉴定符合鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型的各项特性，体外活化系统S9为Aroclor1254诱导雄性SD大鼠肝匀浆。试验设8，40，200，1000，5000 μg/皿5个剂量。将受试药物配制成0.08，0.4，2，10，50 mg/ml 5个浓度，0.055 MPa灭菌20 min，试验时，每皿加入各个剂量组受试物0.1 ml。同时设立自发回变组、溶媒对照组和阳性对照组。每组设3个平皿。在加 S9与不加 S9混合液的条件下以平板掺入法进行试验，阳性对照组所用阳性物为敌克松、2-氨基芴、丝裂霉素C和1, 8-二羟基蒽醌。若受试物的回变菌落数为自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量-反应关系则判定为阳性。试验在相同条件下进行2次以确保结果的可重复性。

2.2 CHL细胞染色体畸变试验

采用生长状态良好的CHL细胞进行试验。用0.25 %的胰酶将细胞消化，吹打均匀后重新分瓶培养，接种的细胞密度为1×105个/ml。试验在代谢活化（加S9）和非代谢活化（不加S9）条件下进行。非代谢活化条件下，受试药品与细胞分别接触4，24 h，代谢活化条件下，受试样品与细胞接触4 h。低、中、高剂量组药物终浓度均分别为250，500，1000 μg/ml。试验同时设阴性对照组和阳性对照组。各组收获细胞前4 h加入终浓度为0.8 μg/ml的秋水仙碱，胰酶消化，离心收集细胞，用0.075 mol/L氯化钾溶液将细胞进行低渗处理，甲醇-冰醋酸液固定，离心，取混匀沉淀物常规制片，姬姆萨染色。油镜下观察染色体结构畸变种类、频率，每例样本镜检200个中期相细胞，记录染色体数目及形态的变化。

2.3 小鼠骨髓细胞微核试验

取健康ICR小鼠50只，按体重随机分为供试品500，1000，2000 mg/kg 3个剂量组、阴性对照组和环磷酰胺50 mg/kg阳性对照组，每组10只，雌雄各半。各组小鼠分别灌胃给予相应的药物溶液20 ml/kg，阴性对照组经口灌胃给予等容积的灭菌注射用水。采用30 h两次给药法，即两次给药间隔24 h，于第二次给予受试物后6 h将动物颈椎脱臼处死，取胸骨骨髓常规制片、姬姆萨染色。显微镜阅片，每只小鼠骨髓涂片观察2000个嗜多染红细胞（PCE），计数出现微核的PCE，计算微核率，微核率以千分率表示。每只小鼠骨髓涂片至少观察200个PCE细胞，并计算嗜多染红细胞与总红细胞[正染红细胞（NCE）+PCE]的比例。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 Ames试验结果

受试物各剂量组在加/不加S9（+/-S9）条件下各菌株回变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍，各剂量组间亦无剂量反应关系。两次试验结果表明，在本试验条件下，在加与不加代谢活化系统的情况下，受试物为致突变阴性，结果见表1、表2。

表1 小儿牛黄清心散Ames试验结果（，第1次试验）

表1 小儿牛黄清心散Ames试验结果（，第1次试验）

注：**P＜0.01 vs 阴性对照组；1) 敌克松50 μg/皿；2) 2-氨基芴10 μg/皿；3) 丝裂霉素C 0.5 μg/皿；4) 1,8二羟基蒽醌50 μg/皿

组别 活化系统TA97a回变菌落数（n=3)TA98 TA100 TA102 TA1535阴性对照组 -S9 126±8 34±5 137±8 259±12 33±3 132±11 38±3 147±10 253±11 36±3阳性对照组 -S9 2147±9911)** 1965±1111)** 993±721)** 873±783)** 429±611)**2261±1202)** 2147±1052)** 1149±742)** 980±1114)** 309±242)**自发回变组 -S9 125±9 31±6 139±8 263±11 38±6 135±7 35±3 148±9 259±12 38±6 5000 μg/皿 -S9 107±13 29±5 134±11 241±7 32±3+S9 115±6 34±3 133±7 251±12 33±4 1000 μg/皿 -S9 117±14 32±6 136±13 265±8 35±6+S9 125±8 37±4 145±12 257±13 40±5 200 μg/皿 -S9 123±8 32±3 142±9 263±11 38±3+S9 127±11 38±3 153±8 265±14 34±2 40 μg/皿 -S9 129±12 35±4 136±12 259±10 34±4+S9 134±13 39±5 143±14 254±7 37±5 8 μg/皿 -S9 127±6 32±5 139±8 258±9 34±5+S9 131±5 40±4 140±12 264±11 35±4给药组

表2 小儿牛黄清心散Ames试验结果（，第2次试验）

表2 小儿牛黄清心散Ames试验结果（，第2次试验）

注：**P＜0.01 vs 阴性对照组；1) 敌克松50 μg/皿；2) 2-氨基芴10 μg/皿；3) 丝裂霉素C 0.5 μg/皿；4) 1,8二羟基蒽醌50 μg/皿

组别 活化系统TA97a回变菌落数（n=3）TA98 TA100 TA102 TA1535阴性对照组 -S9 120±11 32±4 145±10 260±8 36±4 135±7 36±3 143±10 265±9 38±2阳性对照组 -S9 2148±1191)** 2035±811)** 1061±911)** 869±343)** 423±371)**2125±1122)** 2412±2332)** 1099±602)** 855±814)** 297±502)**自发回变组 -S9 125±10 34±5 149±9 259±10 36±6 137±5 37±4 144±8 263±14 37±4 5000 μg/皿 -S9 112±11 32±3 126±9 256±10 30±3+S9 124±9 34±4 137±10 252±11 31±3 1000 μg/皿 -S9 122±7 33±3 134±5 261±8 40±5+S9 136±9 38±5 141±13 257±12 34±4 200 μg/皿 -S9 121±13 35±3 137±13 258±12 34±3+S9 138±12 38±3 143±12 261±11 36±3 40 μg/皿 -S9 124±9 33±3 140±14 265±11 40±4+S9 132±9 40±4 147±12 255±10 37±3 8 μg/皿 -S9 125±8 36±2 143±8 264±9 35±3+S9 141±9 37±4 143±15 263±12 38±4给药组

3.2 细胞染色体畸变试验

在代谢和非代谢活化条件下，阳性对照组细胞畸变率与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各受试药品组细胞畸变率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），各剂量组畸变率未呈现剂量反应关系，表明受试药物在250～1000 μg/ml剂量范围内，CHL细胞染色体畸变试验结果为阴性，见表3。

表3 小儿牛黄清心散CHL细胞染色体畸变试验结果

3.3 微核试验结果

小儿牛黄清心散给药组与阴性对照组相比，PCE/（NCE+PCE）差异无统计学意义（P＞0.05），阳性对照组与阴性对照组相比，PCE/（NCE+PCE）差异有统计学意义（P＜0.01），表明小儿牛黄清心散对骨髓细胞的造血功能没有产生抑制意义（P＞0.05），阳性对照组骨髓微核发生率与阴性对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），见表4。

表4 小儿牛黄清心散对小鼠骨髓细胞微核率的影响

4 讨论

经细菌回复突变试验预试验发现，受试菌株TA100在小儿牛黄清心散作用浓度达最大剂量5000 μg/皿时，细菌回变菌落数无明显减少，各剂量组与阴性对照组之间差异无统计学意义，表明小儿牛黄清心散在5000 μg/皿及以下剂量对试验菌株无毒性作用。因此，正式试验时选用最高剂量5000 μg/皿，其余剂量按指导原则要求分别设定为1000，200，40，8 μg/皿。

在进行染色体畸变试验时，由于细胞培养所用培养基一般对热敏感，因此可将小儿牛黄清心散预先灭菌处理后，再用DMEM培养液进行配制。本品在浓度较高时，如5 mg/ml浓度时对CHL细胞未显示出细胞毒性，但易沉淀在培养瓶底部影响细胞生长和细胞状态观察，并对后续染色体试验产生影响，因此根据指导原则要求，本研究试验最高剂量选用1 mg/ml，试验可操作性和结果良好。

急性毒性试验研究发现，小儿牛黄清心散对啮齿类动物毒性低，急性毒性未求出LD50。根据药物遗传毒性研究技术指导原则，我们在小鼠骨髓细胞微核试验中，试验最高剂量设为2000 mg/kg BW，中、低剂量组设定为1000，500 mg/kg BW。

根据3项遗传毒性试验结果，可认为小儿牛黄清心散在本试验剂量范围内未见遗传毒性作用。