多发性硬化相关细胞因子的表达水平及和意义

韩 凌 徐婉茹

菏泽市立医院神经内科，山东 菏泽 274000

多发性硬化(MS)是一类中枢神经系统脱髓鞘疾病，引起该病主要因素为自身免疫系统缺陷，为一种已达成共识的免疫性疾病[1]。既往研究认为[2]，该病发病机制与患者感染某种病毒有关，而感染病毒与中枢神经系统髓鞘存在相似抗原，上述两种相似抗原引起错误的免疫识别，诱发自身免疫反应。目前部分研究证实[3]，MS疾病发生、发展过程中，CD4+T细胞在其中发挥一定作用，起介导作用。近年来，随着医学检验技术不断发展，新型CD4+T效应性T细胞被发现，上述细胞分泌白介素-17等前炎性因子，在多种疾病中发挥重要作用，常见为自身免疫性疾病、感染和肿瘤。研究表明，动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠体内发现Th17所分泌细胞因子IL-17水平增高[4]。现阶段对Th17细胞及其相关因子在MS疾病患者发表相关报道不多。本文探讨多发硬化相关细胞因子的研表达水平其意义。

1 资料与方法

1．1一般资料抽取菏泽市立医院2016-01-2017-12收治的MS患者60例为观察组，另选取同期30例健康体检者为对照组。纳入标准[5-6]：(1)观察组患者经临床医师诊断确诊为MS；(2)治疗依从性高，能配合医护人员；(3)经过家属、患者同意后自愿参与本次研究；(4)无自身免疫性疾病或服用免疫制剂者。排除标准：(1)障碍、失语、严重认知功能障碍者；(2)既往存在精神病史或家族史者；(3)一般资料不全者；(4)合并脑出血、脑梗死患者。对照组男18例，女12例，年龄28～54(41.5±3.4)岁。观察组男45例，女15例，年龄27～52(42.6±3.7)岁。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1．2方法

1．2．1 标本采集：收集外周静脉血，放置于乙二胺四乙酸抗凝管中，5 mL/管，抽取2管。采取Ficoll分层法分离PBMCs，实验过程中将浓度调整至2×106个/mL，实验开展过程中及时将细胞悬液中往内添加单克隆体anti-CD3 0，2 μg/mL，anti-CD28 1 μg/mL。同时将细胞悬液分为三部分：①将其放置于6孔板内，同时往内部添加5% CO237 ℃，放置在孵箱中培育20 h，可提取RNA。②往内添加96孔板内，往内部添加于5% CO237 ℃，放置于孵箱中培育72 h，同时吸取上清液，采用ELISA检测。③培养管内放置5 mL，并添加蛋白转运阻滞剂，置于5% CO237 ℃孵箱内培育4 h，后予以细胞染色。

1．2．2 检测：试验检测采取Trizol一步法，并提取单个核细胞RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作。RT-PCR反应体系如下：Taq酶，IL-17，内参GAPDH上下游引物共0.5 μL，模板cDNA，MgSO4，dNTP共1 μL，5 μL 10×PCR Buffer，15 μL ddH2O，共50 μL。反应条件：预变性为5 min 95 ℃、30次循环次数，同时利用72 ℃延伸5 min。同时往内添加1.2%琼脂糖凝胶，并在此基础上于120 V下电泳，后采取Bio-capt凝胶成像系统对结果加强分析。引物为Primer 5.0设计，IL-17上引流物为5’-GGACTGTGATGGTCAACCTGA-3’，下引流物5-TCATGTGGTAGTCCACGTT-CC3’；GAPDH上游引物：5’-GCATGGCCTTCCGTGTCC-3’，下游引物：5’-TGAGTGTGGCAGGGACTC-3’。试验开展过程中采取双抗体夹心法，并利用ELISA试剂盒可对细胞上清液中IL-17、IL-6、IL-23进行操作，严格按照试验说明书进行，试验操作中标准品和标本各孔吸光度值读取应在波长450 mm处。

1．2．3 治疗：将纳入60例MS患者(观察组)按照残疾状况量表(EDSS)[6]分为3组，A组(EDSS<4分)24例，B组(EDSS≥4～6分)26例，C组(EDSS≥6～9分)10例，所有患者予以国药集团容生制药有限公司甲泼尼龙针(批准文号：国药准字H20030727，剂量40 mg)治疗，1周内前3 d 1.0 g肌内注射，1次/d，后4 d予以0.5 g肌内注射，1次/d。甲波尼龙冲击治疗后1周并予以许昌奥森制药有限公司生产强的松片(批准文号：国药准字H41021232，剂量5 mg)60 mg/d，渐递减后1个月内停服，并予以胃黏膜保护剂，口服强的松片干预3周，共治疗1个月。再次对各项因子进行检测，操作方式同上。

1．3观察指标观察2组IL-17、IL-23、IL-6等因子水平，比较观察组治疗前后各项血清指数，分析治疗前后MS患者相关细胞因子与EDSS的相关性。

2 结果

2．12组相关因子比较观察组IL-17、IL-23、IL-6水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2．2A组、B组、C组治疗前后相关因子比较治疗前3组IL-17、IL-23、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后3组IL-17、IL-23、IL-6水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 2组相关因子比较

2．3治疗前后IL-23、IL-17、IL-6与EDSS的相关性治疗前IL-23与EDSS呈明显负相关，IL-17与EDSS、IL-6与EDSS呈正相关，治疗后IL-23与EDSS呈明显负相关，IL-17与EDSS、IL-6与EDSS呈正相关。见表3。

3 讨论

慢性进展性中枢神经系统脱髓鞘为MS特征性表现，全世界患病人数100万，常见患病人群以中青年为主，患者临床症状表现多以乏力、共济失调、视野缺损等，会引起患者出现一系列认知障碍，常见为感觉、运动、神经，若早期未及时予以措施干预，会影响到后续自理能力，为家庭造成严重负担[7-8]。目前MS发病机制不明确，除与自身免疫联系密切外，病毒感染、遗传倾向、环境因素等均在MS发病中起到作用[9-10]。现阶段对MS相关病因研究侧重点为动物实验模型上，一项有关小鼠实验结果证实，与正常小鼠群相比较，自身免疫性脑脊髓炎小鼠机体内部Th1细胞水平会呈现一定上升，相比自身分泌IL-12水平偏高，表明Th12参与疾病发病[11-12]。但另一项实验显示[13-14]，一旦阻断机体内IL-12与其受体之间结合，或小鼠体内IL-12清除过后，小鼠仍然易感染自身免疫性脑脊髓炎。

Th17作为近年来研究中发现效应性CD4+T细胞，分泌IL-17、IL-23以及TNF-α等前炎性因子，并起到促炎作用。对临床自身免疫疾病患者研究中，常见为系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等疾病，血清、局部组织检测中发现Th17细胞高水平[15-16]。韦云飞[17]在一项小鼠实验中发现，自身免疫性脑脊髓炎小鼠病情进展发生与机体内部IL-17、IL-6水平呈正相关，且对存在缺陷IL-17小鼠或IL-17受体经封闭处理后小鼠对脑脊髓炎反应性降低。研究证实[15]，Th17细胞在MS发病中发挥重要作用，而Th17细胞分化中最为重要的细胞因子分别为IL-6、IL-23、IL-21等。因此，对上述炎性因子在机体内水平及其激素治疗对其影响进行研究，能阐明MS发病机制，为后续干预、治疗提供理论依据[18-19]。

SHAYGANNEJAD等[20]研究得出，因IL-17因子会通过脑部血脑屏障，移行过程中进入中枢系统会进一步分泌IL-17及炎症性CD4+T细胞，上述因子综合作用下会加重患者病情，导致中枢炎症性脱髓鞘，进一步促使MS患者病情发展。我国对Th17相关研究报道偏少，本研究显示，与正常健康人群相比，MS患者机体内TH17相关因子水平升高(P<0.05)。MS患者体内Th17细胞比例显著高于对照组，MS患者Th17细胞数量与其功能增强具有一致性[21-22]。IL-6和IL-23作为IL17紧密相连细胞因子，为抗原提呈细胞分泌，作为诱导初始CD4+T细胞向Th17细胞分化及其IL-17产生关键因子[23-24]。因此，MS患者Th17细胞增加与其诱导因子IL-6、IL-23密切相关。

表2 A组、B组、C组治疗前后相关因子比较

表3 治疗前后IL-23、IL-17、IL-6与EDSS相关性

甲泼尼龙作为急性期MS患者常用治疗药物。本文中MS患者按照ESDD分级分为3组，同样予以激素治疗，与治疗前相比，IL-23、IL-17、IL-6水平均相应下降。虽然MS患者临床症状缓解，但与健康人群相比，IL-23、IL-17、IL-6仍然偏高。国内外部分研究证实[25-26]，长期应用激素治疗并不能有效改善MS患者预后，但予以适量延长激素治疗是否能控制IL-23、IL-17、IL-6水平正常，并预防MS复发，仍需进一步研究。本文显示，治疗前后IL-23与EDSS呈明显负相关，IL-17与EDSS、IL-6与EDSS呈正相关。提示上述3个炎性因子在MS发病中存在同向协调关系。而对MS临床治疗多采用甲波尼龙干预，临床实际应用过程中能作为MS急性期治疗用药，进一步降低MS患者IL-17、IL-23、IL-6水平，为临床治疗提供佐证。但因长期应用大量激素干预，后续不良反应多，因此，为减少治疗过程中对患者进一步损伤，寻找替代品显得尤为重要[27-28]。IL-23和IL-17作为近些年来研究中对MS发生、发展中起重要作用的细胞因子，Th17细胞及其相关因子会参与MS进展，对其相关确切机制仍需进一步研究[29-30]。因此，对其深入研究能进一步揭示MS发生、发展机制，为寻求后续新的治疗方法提供依据。在后续研究中，需要加大样本量深入研究，以推进Th17细胞检测在MS诊断中临床应用[31-32]。

MS发病与IL-17、IL-23、IL-6相关，采取甲泼尼龙治疗1个月，上述因子水平下降。但由于本文究仍建立在其他学者基础上，对Th17相关作用机制尚不明确，因此，为进一步证实该研究准确性，需加大样本量、研究时间，证实Th17细胞在MS诊断中的应用价值。