柠檬烯微生物转化及其相关酶的研究进展

张璐璐,范 刚,*,何 进,黄 文,任婧楠,潘思轶

(1.华中农业大学食品科技学院,环境食品学教育部重点实验室,湖北武汉 430070; 2.华中农业大学生命科技学院,湖北武汉 430070)

柠檬烯(limonene)作为一种重要的功能性单萜,已经被发现存在于300多种植物中。单萜类化合物是萜烯中最具代表性的分子,由于其感官特性以及抗菌、抗癌、解痉、抗高血糖、抗过敏、抗炎、免疫调节等的特性使它们广泛的应用于医药、化妆品、农业和食品工业等行业[1]。柠檬烯是柑橘加工产业的副产物,全世界每年的产量预计超过50 000吨,其价格非常便宜[2]。但柠檬烯的化学性质不稳定,香气值较低,所以其应用受到一定的局限性[3]。具有与柠檬烯相同骨架的含氧单萜芳香化合物,比如α-松油醇(α-terpineol)、紫苏醇(perillyl alcohol)、香芹醇(carveol)等,不仅具有独特的芳香气味,是高级香精香料的原料,而且还具有较高的经济价值和药理作用。

目前对于含氧单萜化合物的制备方法主要有化学合成、从天然动植物原料中提取以及微生物转化。化学合成法具有产率高、成本低的特点。但是因为其较低的区域和立体选择性而低质量,使得最终得到的产品是混合物。此外,化学合成法获得的芳香化合物不能被认为是天然的,不仅需要较高的成本(高压力和温度),还会产生环境问题(使用大量有机溶剂)。

直接从天然动植物原料中提取以及利用微生物转化法来制备的芳香化合物可以被认为是“天然的”,标记“天然的”香料产品更受消费者的青睐。然而,直接从动植物原料中提取芳香化合物也存在着不足之处。由于季节性(产品的可获得性与一年中的某些时期有关)、低产量以及生态和社会问题,导致产品的价格居高不下[4]。与之相比,微生物转化法是通过微生物整体细胞或产生的酶将复杂的底物进行结构修饰和改造,其本质在于利用微生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物(或外源化合物)进行催化反应,使一种化合物转变成更有经济价值的产物[5]。微生物转化法具有高对映选择性,可得到光学纯的芳香化合物,提高产品的感官特性;全年连续生产,无季节干扰;采用较不严格的工艺参数(从而降低能源成本和使用对环境有害的试剂);工艺条件可以被控制和优化。目前已被广泛用于有机合成、香料生产、新药研发、药物结构修饰与改造及药物代谢模型预测等方面。因此,利用微生物转化生产香料已经成为研究的热点。

利用微生物转化法对柠檬烯进行结构修饰,已经成为获得含氧单萜的重要途径。因此,本文对柠檬烯的微生物转化产物作了简要概述,重点介绍了近年来柠檬烯微生物转化的相关研究,进一步总结了柠檬烯微生物转化涉及到的相关酶,最后概述了微生物转化实现工业化需要研究的发展方向,以期为今后单萜生物转化的研究提供参考。

1 柠檬烯微生物转化的主要产物

通过生物转化对柠檬烯进行结构修饰来制备单萜芳香产品,是具有重要应用前景的新产品开发方法。如图1,具有与柠檬烯(1)相同骨架的含氧化合物主要有1,2位的环氧化产物柠檬烯-1,2-环氧化合物(limonene-1,2-oxide,9)和其水解产物柠檬烯-1,2-二醇(limonene-1,2-diol,8)[6];C3位羟基化产物异薄荷烯醇(isopiperitenol,13)和异薄荷烯酮(isopiperitenone,14)[7];C6位羟基化产物香芹醇(2)和香芹酮(carvone,3)[8];C7位羟基化产物紫苏醇(10),进一步氧化产物紫苏醛(perillic aldehyde,11)和紫苏酸(perillic acid,12)[9];C8位氧化产物松油醇(19)[10];8、9位环氧化产物柠檬烯-8,9-环氧化合物(limonene-8,9-epoxide,6)[11]。目前,柠檬烯的氧化产物主要是柠檬烯发生烯丙基的羟基化(3,6,7位)得到的醇,醇氧化成羰基而得到的酮,双键氧化(1,2和8,9双键)得到的环氧化物,在4和10位还没有的到相应的氧化产物。

图1 柠檬烯微生物转化的主要产物Fig.1 Biotransformation products of limonene

柠檬烯-1,2-环氧化物是重要的医药中间体,在神经和精神疾病、咳嗽、消炎等治疗方面均有应用。此外,此环氧化物是有机合成过程中重要的中间体,它的分子结构中存在着十分活泼的环氧基团,可以通过与多种亲核试剂的开环反应获得一系列重要的有机化合物[12]。柠檬烯-1,2-二醇是一种无色至微黄色的油状液体,具有清凉的薄荷味。它常被用作布丁、饮料、口香糖、明胶、布丁和硬糖的调味剂。

异薄荷烯醇具有麝香-薄荷醇特征气味,可作为香料工业的基础原料[13]。其进一步的代谢产物薄荷呋喃(18)和薄荷酮(19)具坚果香、咖啡香,可调配食用香精。研究表明左旋薄荷酮具有清凉、镇痛、止痒、抗抑郁的功效[14]。

香芹系列香料是调配高级食品和化妆品香精的重要原料,其中代表物质是香芹醇、香芹酮、二氢香芹酮(4)、二氢香芹醇(5)。由于香芹类化物的各种生物学活性,还被广泛的应用于医药、化学、口腔卫生等行业。研究表明香芹类化合物具有抗癌的作用,香芹醇对乳腺癌有抑制作用[15],香芹酮对肺腺瘤、胃前肿瘤形成、乳腺癌以及结肠癌都有预防作用。并且香芹酮还有强烈的止痉挛的作用。最后,香芹酮还可以作为抗菌剂和天然的杀虫剂[4]。

紫苏醇是带有香气的单萜类天然活性物质,在医药、食品和化妆品等行业具有广阔市场空间。研究表明,紫苏醇具有较高的抗肿瘤活性,在发达国家,紫苏醇已广泛用于胶质母细胞瘤、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌等的临床治疗[16]。除此之外,紫苏醇还可以用于肾脏疾病、白血病、肝损伤等的治疗。紫苏醛是紫苏的独特芳香气味成分,不仅可以用于调制茉莉、水仙、柠檬、留兰香以及香辛料等香精香料,还可以刺激嗅觉神经,使胃液分泌、增进食欲。紫苏醛具有抗菌活性,对皮肤丝状菌和绿脓杆菌、沙门氏菌有较为明显的抑菌效果,可以作为天然防腐剂和抗真菌剂。此外,紫苏醛还具有镇静、镇痛、抗癌等的生物活性[17]。紫苏酸是一种无气味的固体,对细菌和真菌具有强烈的抑菌活性,对恶性黑色素瘤细胞的转移具有抑制作用。

α-松油醇有稳定的丁香花、铃兰花等花香香气,是我国重要的出口香料品种,其广泛存在于松节油、茶树精油、柠檬油等精油中。不仅可用于调配柠檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精,还用于医药、农药、塑料、肥皂、油墨、仪表和电讯工业中。此外,α-松油醇还可以作为有机合成中间体,用于制备其他更有价值的物质,如二氢松油醇、乙酸松油酯、香叶醇等。目前研究发现α-松油醇的药理活性主要有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎症以及抗痉挛等的作用[4]。

2 柠檬烯的微生物转化

近年来,随着国内外天然、健康市场消费理念的转变,天然的含氧单萜类化合物的需求快速增长,以生物技术生产的香精香料被欧美及世界各国的食品法规界定为“天然的”[18]。因此,通过生物技术制备单萜芳香产品,是新产品开发的新的思路和方法。真菌、细菌、酵母、微藻都可以对柠檬烯进行生物转化,其中真菌最多,细菌和微藻较少(表1)。

表1 柠檬烯的微生物转化菌株及其转化产物 Table 1 The microorganisms used in limonene biotransformation and their biotransformation products

2.1 真菌对柠檬烯的生物转化

真菌是生物转化柠檬烯常用的转化菌种。真菌种类繁多、营养要求相对较低、易于培养,是一种有效的生物转化载体。其中青霉(Penicilliumsp.),黑曲霉(Aspergillussp.),尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)是研究比较深入的转化菌,已被广泛应用于柠檬烯微生物转化的研究中。

2.1.1Penicilliumsp.对柠檬烯的生物转化Penicilliumsp.对柠檬烯的氧化作用主要集中于柠檬烯的C8位。Rottava等[19]分离得到一株沙门柏干酪青霉P.camembertiiATCC 4845能够将柠檬烯转化生成α-松油醇[(24.38±2.78) mg/L]。Badee等[20]利用指状青霉P.digitatum(NRRL 1202)转化柠檬烯生成α-松油醇。Molina等[21]从巴西水果中筛选分离出能够氧化柠檬烯的Penicilliumsp.,将柠檬烯转化生成α-松油醇。Tai等[10]研究P.digitatumDSM62840对柠檬烯的转化作用,主要产物是α-松油醇,还有少量的香芹酮和香芹醇,并对该转化过程进行优化使得α-松油醇的产量达到833.93 mg/L。

2.1.2Aspergillussp.对柠檬烯的生物转化 Rottava等[19]从400株微生物中筛选分离得到3株黑曲霉能够将柠檬烯转化生成α-松油醇,分别是A.nigerATCC 16404[(15494.34±193.87) mg/L]、A.nigerATCC 9642[(688.13±41.27) mg/L]、A.nigerATCC 1004[(172.07±32.94) mg/L]。Molina等[21]从巴西水果中筛选分离出Aspergillussp.,能够氧化柠檬烯生成香芹酮。Garcia-Carnelli[22]采用两种培养基和培养体系研究A.niger对柠檬烯的转化作用,主要产物是顺式/反式-香芹醇、香芹酮、二氢香芹酮、紫苏醇、α-松油醇。

2.1.3Fusariumoxysporum对柠檬烯的生物转化 Molina[2]等利用Fusariumoxysporum152B对R-(+)-和S-(-)-柠檬烯进行微生物转化,结果显示该菌株可以将S-(-)-柠檬烯转化生成3.7 g/L的柠檬烯-1,2-二醇,将R-(+)-柠檬烯转化生成4 g/L的α-松油醇。Bicas等[23]采用Fusariumoxysporum152B中产生碱性脂肪酶的过程与R-(+)-柠檬烯产生α-松油醇过程相结合的方法,得到2 g/Lα-松油醇。虽然α-松油醇产量有所下降,但同时能够产生碱性脂肪酶,从工业应用的角度来看,是一种好的方法。

2.1.4 酵母对柠檬烯的生物转化 除此之外,酵母也被用于柠檬烯的微生物转化。Pinheiro和Marsaioli[24]利用皮状丝孢酵母TrichosporumcutaneumCCT 1903全细胞转化柠檬烯,产物为柠檬烯-1,2-二醇。Ferrara等[25]的研究发现,解脂耶氏酵母YarrowialipolyticaATCC 18942对柠檬烯有羟基化作用,能将柠檬烯转化生成紫苏酸,产量最高达到855 mg/L。

2.1.5 其他真菌对柠檬烯的生物转化 内生真菌指那些在其生活史中的某一定阶段或全部阶段生活在植物组织内部,对宿主没有造成明显病害症状的真菌。它不仅能够产生与宿主植物相同或相似的功能性代谢产物,也可以产生其他新类型的化合物。Bier等[26]从火炬松中分离得到一株内生真菌拟茎点霉Phomopsissp.,在不同的培养条件下，能够将柠檬烯转化生成0.536 g/L香芹酮和2.08 g/L柠檬烯-1,2-二醇,还有少量的α-松油醇、香芹醇、薄荷醇。

此外,还有一些其他的真菌也可以用于柠檬烯的生物转化。Sales等[27]利用荷花炭疽菌Colletotrichumnymphaeae对R-(+)-和S-(-)-柠檬烯进行微生物转化,主要产物是柠檬烯-1,2-二醇,产量可以达到3.34～4.01 g/L,这是目前文献报道该产物产量最高的一种微生物。Trytek等[28]采用小被孢霉Mortierellaminutissima对柠檬烯进行转化研究,转化产物为紫苏醇和紫苏醛。并通过过氧化氢酶分解过氧化氢生成氧的方法,使得紫苏醇的产量提高了3.6倍。

2.2 细菌对柠檬烯的生物转化

细菌转化柠檬烯研究比较多的是假单胞菌Pseudomonassp.。Bicas等[29]利用荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens氧化柠檬烯生成柠檬烯-1,2-环氧化物和α-松油醇。Chatterjee[30]发现恶臭假单胞菌PseudomonasputidaMTCC 1072能够高效的氧化柠檬烯生成紫苏醇。Mirata等[31]也发现PseudomonasputidaDSM 12264能够氧化柠檬烯的C7位,主要产物是紫苏酸,并利用原位分离技术提高紫苏酸的含量,使得紫苏酸的含量在7 d之后达到31 g/L。Soares-Castro等[32]在研究假单胞菌Pseudomonassp. strain M1的转化作用时,发现该菌株不仅可以将β-月桂烯转化生成月桂烯醇,还可以将柠檬烯和α-蒎烯分别转化生成柠檬烯-1,2-二醇和α-松油醇。

海洋微生物也拥有独特的萜类合成的基因,有丰富的萜类合成酶。蓝文健等[33]研究了南海海洋细菌嗜水性气单胞菌Aeromonashydrophila和创伤弧菌Vibriovulnificus对柠檬烯的转化作用,结果表明两株海洋细菌都能对柠檬烯进行不同程度的氧化、还原、水解、酯化、开环等反应,生成香芹醇、柠檬烯-1,2-二醇、异薄荷烯醇、异薄荷烯酮。李厚金等[34]从南海大亚湾中筛选出3株对柠檬烯有显著生物催化转化作用的海洋细菌,分别是霍乱弧菌Vibriocholerae、美人鱼李斯道菌Listonelladamsela和溶藻弧菌Vibrioalginolyticus,转化产物主要是紫苏酸、柠檬烯-1,2-二醇、香芹醇、香芹酮、紫苏醇。

此外,鞘脂菌Sphingobiumsp.也被用于柠檬烯的微生物转化。Bicas等[35]以葵花油作为有机相,利用双相体系提高鞘脂菌Sphingobiumsp.转化柠檬烯生成α-松油醇的产量,使得α-松油醇的产量最终达到130 g/L。

2.3 微藻类对柠檬烯的生物转化

微藻是一类重要的光合微生物,也被用于单萜类化合物的生物转化。光能是微藻生长的唯一能量来源。因此,与其他微生物相比,微藻的大规模培养更为简单和廉价。Ghasemi等[36]利用卵囊藻Oocystispusilla对单萜类化合物进行生物转化,该藻类不仅能够氧化柠檬烯生成反式-香芹醇、香芹酮以及反式-柠檬烯环氧化物,还原香芹酮的碳碳双键生成顺式/反式-二氢香芹酮,还能氧化香芹醇生成香芹酮和二氢香芹酮。

Rasoul-Amini等[37]利用海藻酸钙固定小球藻Chlorellasp.、卵囊藻Oocystissp.、聚球藻Synechococcussp.和衣藻Chlamydomonassp.,发现所有的微藻都能转化柠檬烯和香芹酮,其中柠檬烯的转化产物有顺式/反式-香芹醇、香芹酮以及顺式/反式-柠檬烯-1,2-环氧化物。香芹酮的转化产物有顺式/反式-二氢香芹酮、二氢香芹醇。

3 柠檬烯微生物转化的相关酶

在对柠檬烯微生物转化进行深入研究的同时,发现存在一批有丰富的特异性酶的微生物。酶基因的分离、克隆、表达和调控已经成为研究热点。通过基因工程技术,可望实现含氧单萜芳香化合物的工业化高效生产。在柠檬烯的转化过程中有多种酶的参与,如:细胞色素P450酶、羟化酶,脱氢酶、环氧化酶、水合酶等(表2)。

3.1 细胞色素P450酶(CYPs)

CYPs是柠檬烯微生物转化中的常用酶,它是一类含有铁血红素的单加氧超家族,在细菌、真菌和高等生物中广泛分布,具有转化内源性物质(如胆固醇、类固醇、脂肪等)和催化外源性物质(如药物、环境物质)的功能[38]。

CYP153A6是从分枝杆菌Mycobacteriumsp. strain HXN-1500中分离得到[39],能够特异性的羟基化柠檬烯的C7位置生成紫苏醇。通常单萜类化合物都是由前体单元异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)和其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)在香叶基焦磷酸合成酶(geranyl diphosphate synthase,GPPS)的作用下形成GPP。IPP和DMAPP是通过甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA)或丙酮酸磷酸甘油醛途径(methylerythritol 4-phosphate,MEP)合成的。GPP在柠檬烯合成酶(limonene synthase,LS)的作用下可以形成柠檬烯。进一步的研究表明,以大肠杆菌为表达宿主,通过异源表达MVA、GPPS、LS以及CYP153A6,可以实现从简单碳源到柠檬烯和紫苏醇的转化[40]。最终1%的葡萄糖可以产生435 mg/L的柠檬烯和105 mg/L紫苏醇,这也意味着可以利用微生物酶和宿主去实现从简单糖到价值更高的萜类化合物的生产,为今后生物法合成萜类化合物提供了理论依据和技术支持。此外,Korman等[41]设计了一个体系,包括糖酵解途径、MVA途径以及单萜类合成酶等在内的27个酶,实现从葡萄糖到各种单萜类化合物的转化,并且该体系稳定,能够连续工作5 d以上。

CYP102A1(P450BM3)是一个可以自给自足的单加氧酶,包含一个血红素结构域,一个双黄素还原酶结构域和它们的连接区域。这个独特的结构使其具有比其他P450更高的催化及转化效率。P450BM3不仅可以利用NADPH作为电子供体,催化长链脂肪酸近末端位置的羟化,还可以将柠檬烯转化生成一系列的氧化产物。Seifert等[42]通过使用半理性的方法,使得柠檬烯C7位羟基化的选择性高达97%。并且这种方法还可用于其它柠檬烯羟化酶的研究,比如地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis的CYP102A7[43]和白链霉菌Streptomycespeucetius的细胞色素CYP147F1[44]。其中CYP102A7不仅可以转化脂肪酸,还可以转化一些萜类化合物。它可以将柠檬烯转化生成柠檬烯-8,9-环氧化物、柠檬烯-1,2-环氧化合物以及香芹醇[43]。

CYP101A1(P450cam)能够催化单萜D-樟脑的羟基化作用,单孢氧还蛋白还原酶(putidaredoxin reductase,PdR)和假单孢氧还蛋白(iron-sulfur protein putidaredoxin,Pd)是P450cam的辅助蛋白,将完整的P450酶系(P450cam、PdR和Pd)在大肠杆菌中表达,能够催化柠檬烯的羟基化作用,将柠檬烯催化生成紫苏醇[45]。此外,P450cam也被报道能够对柠檬烯C1,2位、C3位和C6位进行氧化。P450cam的底物通过氢键和疏水作用力同中心的互补氨基酸残基相连,与血红素催化中心的催化位点相结合,从而被P450cam氧化。Bell等[46]通过对P450cam进行定点突变,改变其活性位点的相关残基,从而提高其对柠檬烯的催化活性。结果发现,所有的突变体都能提高柠檬烯的催化活性,其中柠檬烯的转化产物主要是70%异薄荷烯醇,16%香芹醇和14%柠檬烯-1,2-环氧化物。

此外,还有一些涉及在转化过程中的酶尚在研究之中,尤其是对于柠檬烯的C8位氧化。Tan等[47]的研究发现加入邻二氮杂菲和降低氧气浓度后,α-松油醇的产率下降,但氰化物并没有抑制作用,表明在转化过程中是P450单加氧酶在起作用。Van等[11]用环己烷分离出一株黄色杆菌Xanthobactersp.C20,该菌株能够将柠檬烯生成柠檬烯-8,9-环氧化物,认为催化环己烷羟基化的单加氧酶并不能催化柠檬烯上的环己烯环,而是发生环氧化。8,9位C=C环氧化,然后环氧化物“还原裂解”。环氧化反应通常由P450依赖加单氧酶催化,柠檬烯-8,9-环氧化物被认为是P.digitatum生物转化柠檬烯为α-松油醇的一个中间物。研究表明P.digitatumNRRL1202、分子孢子菌Cladosporium和唐菖蒲假单胞菌Pseudomonasgladioli都有羟基化酶系的底物诱导效应。而指状青霉的诱导系统可能和其他真菌和酵母的羟基化系统一样为P450单加氧酶系。Tai等[10]对P.digitatumDSM62840 转化柠檬烯为α-松油醇的微生物转化过程中的酶进行了初步研究,实验结果发现该生物转化的酶系具有对映体选择性和可诱导性。并且加入氧化酶抑制剂邻二氮杂菲和8-羟基喹啉后,该生物反应均被抑制,初步认为该生物转化酶系可能为细胞色素P-450单加氧酶。Zhang等[48]利用iTRAQ技术研究P.digitatumDSM62840对柠檬烯生物转化的机制,对指状青霉柠檬烯微生物转化的不同时期(0和12 h)的蛋白进行比较,发现细胞色素P450单加氧酶系被涉及在转化过程当中。

3.2 脱氢酶

PseudomonasputidaF1能够通过异丙基苯甲酸途径降解伞花烃,在异丙基苯单加氧酶(cymene monooxygenase)和两个脱氢酶(枯醇脱氢酶和枯醛脱氢酶)的作用下能够将伞花烃转化生成枯茗酸。而P.putidaGS1与P.putidaF1一样,不仅可以利用伞花烃作为唯一的碳源和能量生长,并且可以将柠檬烯转化生成紫苏酸,在柠檬烯转化为紫苏酸的过程中同样涉及两个脱氢酶氧化中间产物紫苏醇和紫苏醛[9]。Cadwallader等[49]利用蔗糖梯度离心以及凝胶柱层析从P.gladioli中分离得到一个α-松油醇脱氢酶(α-terpineol dehydratase),结果表明,在1%的Triton X-100中,该酶以两种形式存在,分别是分子量为94500 Da的单体和206500 Da的二聚体。Petasch等[50]发现解芳烃卡斯特兰尼氏菌Castellanielladefragrans65Phen能够氧化柠檬烯生成紫苏类化合物,通过测定其基因组推测柠檬烯在柠檬烯脱氢酶(limonene dehydrogenase)、香叶醇脱氢酶(geraniol dehydrogenase)、香叶醛脱氢酶(geranial dehydrogenase)的作用下生成紫苏酸。

3.3 羟化酶

肠杆菌Enterobactercowanii6L能够利用柠檬烯作为唯一碳源和能量进行生长。携带E.cowanii6L的染色体片段(CD6-1和CD6-2)的大肠杆菌对柠檬烯有羟基化作用,编码柠檬烯羟化酶,其中柠檬烯羟化酶CD6-1(limonene hydroxylase CD6-1)氧化柠檬烯生成紫苏醇和γ-松油醇,柠檬烯羟化酶CD6-2(limonene hydroxylase CD6-2)氧化柠檬烯生成紫苏醇和α-松油醇[51]。Lupien等[7]从薄荷(Mentha)植物中分离得到柠檬烯-3-羟化酶(limonene-3-hydroxylase)和柠檬烯-6-羟化酶(limonene-6-hydroxylase),分别能够氧化柠檬烯的C3位和C6位,生成异薄荷烯醇和香芹醇。

3.4 环氧化物水解酶

Van等[52]从淡水沉积物样品中分离得到的一株红平红球菌RhodococcuserythropolisDCL14,该菌株能够利用柠檬烯作为唯一碳源和能量生长,并且能够将柠檬烯转化生成柠檬烯-1,2-二醇。利用凝胶柱和离子交换柱对其分离纯化之后得到一个柠檬烯-1,2-环氧化物酶(limonene-1,2-epoxide hydrolase,Re-LEH)[53]。推测在该菌株中存在柠檬烯C1,2位的代谢途径,柠檬烯在1,2-单加氧酶(limonene-1,2 monooxygenase)的作用下引发1,2位C=C的环氧化得柠檬烯-1,2-环氧化物,然后利用LEH转化成相应的二醇[6]。

此外,胶红酵母RhodotorulaglutinisCIMW 147也已经被证明对几种芳基、脂环族和脂肪族环氧化物有环氧化水解的作用,能够水解柠檬烯-1,2-环氧化物生成相应的醇[54]。Johansson等[55]在结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis中发现一个环氧化物酶Mt-LEH,与 Re-LEH 结构是相似的。Ferrandi等[56]收集了来自不同国家、不同温度、不同pH的温泉样品,对其测序并进行分析,发现两个LEH,分别是从来自托木斯克(Tomsk-LEH)和中国(CH55-LEH)的温泉样本中获得的,Tomsk-LEH在氨基酸水平上与Mt-LEH有30%的相似,与Re-LEH 有25%的相似,CH55-LEH与 Mt-LEH 和 Re-LEH都有31%的相似。将其异源表达之后,都能将柠檬烯-1,2-环氧化物生成相应的二醇。

3.5 水合酶

嗜热脂肪芽孢杆菌BacillusstearothermophilusBR388能够利用柠檬烯作为唯一碳源,将其转化为α-松油醇和紫苏醇。携带该菌株9.6 kb染色体片段的大肠杆菌也能以柠檬烯作为唯一碳源生长,并生成相同的产物,研究人员认为该片段编码一个柠檬烯水合酶(limonene hydratase),能够转化柠檬烯生成α-松油醇[57]。Bicas等[35]在研究鞘脂菌Sphingobiumsp.转化柠檬烯生成α-松油醇的过程中发现,厌氧条件更有利于α-松油醇的合成。这表明,涉及在转化过程中的酶是一种辅因子独立的、不可诱导的水合酶,而不是细胞色素P450依赖的单加氧酶系统。

3.6 其他酶类

此外,还有一些酶也是涉及在柠檬烯的转化过程中。Trytek等[58]利用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶氧化柠檬烯,主要产物为香芹酮,还有少量的柠檬烯-1,2-环氧化合物、香芹醇和二氢香芹醇。获得香芹酮最佳的反应条件是pH7.0,1.5%底物,50 ℃,反应时间16～24 h(Trytek,2002)。Aguila等[59]发现海洋真菌Caldariomycesfumago通过氯过氧化物酶氧化柠檬烯生成柠檬烯-1,2-二醇。Groeneveld等[60]在对Pseudomonassp. PWD32的基因组进行分析时发现一个基因簇,编码4个加氧酶,该加氧酶与异丙苯加氧酶(cumene dioxygenase)有很强的同源性,将其表达在PseudomonasputidaS12中能够高效并且高度专一的氧化柠檬烯生成反式-香芹醇。

4 展望

食品的香气和香味会增加人们的愉快感,引起人们的食欲,促进唾液分泌,增强人体对营养成分的消化和吸收,因而,香精、香料是食品中不可缺少的一部分。单萜类化合物是目前用得最多的香料,含氧单萜不仅具有独特的芳香气味,而且还具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等重要的药理作用。在历经改革开放40年后,中国食品工业已站到了以安全、健康、环保为目标的新起点上。食品行业不仅需要创新与提升食品科技水平,还需要考虑营养与健康的多方需求。而通过微生物转化产生的风味萜烯由于其“天然性”和抗菌、抗肿瘤等活性作用完全能适应新的市场需求。

微生物转化具有无需提纯生物酶,酶液不易失活,反应条件易控制等优点。但其依然存在着不足。第一,由于高浓度单萜化合物对菌株的生长和代谢有抑制作用,产酶量下降。而这种抑制作用在液体环境中表现尤为明显。因此工业生产中单萜底物的投料量不高,无法扩大生产。为获得足够的产物,需要多次分批发酵,这些都大大增加了人力成本及资源浪费。因此可以采用固体发酵技术,但影响固体发酵的因素很多,要获得稳定高效的发酵工艺,还需要进一步的深入研究。第二,目前发现的高产菌种种类很少,因此高产菌种的筛选、驯化及其发酵工艺流程的探究,对于风味萜烯的大批量工业化生产具有重大的意义。第三,通过微生物法获得的单萜化合物中杂质多,种类复杂,产物纯化难,所以分离纯化酶制剂将成为解决问题的关键。此外,不仅可以采用基因工程技术对关键酶进行定点突变,改变酶分子的结构,从而提高酶的活力,还可以运用基因重组技术获得高表达关键酶的基因工程菌,通过短周期发酵得到转化酶,对芳香单体进行定向转化。第四,微生物转化底物价格相对较高,增加成本,因此选用丰富而价廉的原材料进行微生物发酵将更具有应用前景。通过合适的酶,以酶促技术结合葡萄糖为底物发酵,降低生产成本,满足消费者和生产商的需要,是一项切实可行的技术。