新疆红肉苹果多酚的纯化、组成分析与抗氧化活性

刘旻昊,齐 娜,邓 红,2,*,孟永宏,2,穆韦曈,郭玉蓉,2

(1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院,陕西西安 710119; 2.国家苹果加工技术研发专业中心，陕西西安 710119)

红肉苹果(MalusniedzwetzkyanaDieck)是一种在新疆有着悠久栽培历史的珍贵种质,其枝、叶、花、果皮及果肉均呈现出微红至深红色[1-3]。红肉苹果结果早,结实力强,且具有耐贫瘠、耐修剪、抗寒、抗旱等良好的抗逆性及丰富的遗传多样性。除此之外,红肉苹果中富含多酚、多糖、有机酸、矿质元素等多种物质,其中苹果多酚及Ca含量几乎是普通白肉苹果中3倍以上,具有十分广阔的应用前景[4-5]。而植物多酚具有防龋齿、抗氧化、抗肿瘤以及预防高血压等多种生理功效,广泛应用于食品、医学等各个领域[6-8]。

目前,对红肉苹果的活性成分研究相对较多的是花青苷,王延玲[9]对新疆红肉苹果“夏红肉”的果皮和果肉中花青苷的成分进行了鉴定,同时还研究了在发育过程中花青苷含量的变化。孙晓红等[10]以白肉苹果“澳洲青苹”为对照,探讨了4种不同品种的红肉苹果果肉在不同发育时期花青苷的含量变化以及与其合成相关的基因表达量,发现红肉苹果“新疆1号”和“红勋5号”果肉中花青苷含量较高。王燕等[11]对红肉苹果“紫红1号”果肉中的花色苷进行了研究,测定其果肉中总酚含量为2523 mg·kg-1FW,花色苷含量为228.3 mg·kg-1FW,鉴定出花色苷的主要成分有9种,同时,还采用FRAP法测定了其抗氧化能力为13.39 μmol/g,几乎是白肉苹果抗氧化能力的7倍,由此可以得出红肉苹果抗氧化活性较强。Wang等[12]研究比较了4种红肉苹果和2种白肉苹果,也发现红肉苹果的抗氧化能力明显高于白肉苹果。苏帆等[13]采用酚酸对新疆红肉苹果的花色苷进行辅色,研究结果表明4种酚酸对红肉苹果花色苷有明显的增色作用并且能提高其稳定性。Schiavano等[14]研究了红苹果新品种-Pelingo苹果果汁对乳腺癌细胞及体外肿瘤增殖的抑制作用,结果表明Pelingo苹果的天然生物活性成分可显著抑制体外肿瘤发生和人乳腺癌细胞的生长。但目前国内外对新疆红肉苹果多酚的提取、纯化及其抗氧化活性的研究还比较少,仅见齐娜等[15]研究了红肉苹果多酚提取条件的优化。

本文在前期获得响应面优化超声辅助提取[15]新疆红肉苹果多酚工艺的基础上,采用大孔吸附树脂纯化多酚提取物,筛选出吸附和解析性能较高的树脂,并优化最佳的纯化条件;进而采用高效液相色谱分析纯化后的新疆红肉苹果多酚的组成成分及含量,最后利用体外抗氧化试验评价红肉苹果多酚抗氧化活性,为进一步探讨新疆红肉苹果多酚的抗癌活性和综合开发利用新疆红肉苹果资源提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆红肉苹果“红勋1号” 2017年9月采自于新疆塔城;X-5N、NKA-9、AB-8、D101、KA-II 5种大孔树脂(表1) 西安蓝晓科技新材料有限公司;标准品(没食子酸、原儿茶酸、表没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B2、绿原酸、4-羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、表儿茶素没食子酸酯、芦丁、金丝桃苷、鞣花酸、槲皮苷、根皮苷、槲皮素) 美国Sigma公司;分析纯的福林酚、碳酸钠、盐酸、氢氧化钠等 西安森博化玻仪器供应站;氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、硫酸甲酯吩嗪(PMS)、总胆汁酸(TBA)、三氯乙酸(TCA)、脂质体等 北京孚博生物科技有限公司。

表1 不同大孔树脂的基本性能参数Table 1 Basic properities of different macroporous resins

SB25-12DTDN超声波机 宁波新芝生物科技股份有限公司;YHLGJ-10真空冷冻干燥 巩义市予华仪器有限责任公司机;Multiskan Go全波长酶标仪 美国热电公司;Thermo高效液相色谱仪 美国热电公司;THZ-C恒温振荡器 苏州培英实验设备有限公司;JJ-2组织捣碎匀浆机 常州市金坛友联仪器研究所;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚的提取 将新疆红肉苹果清洗、切块、去籽后打碎成匀浆,从中取出5 g并加入一定比例75%乙醇溶液,放入冷凝回流器中,按照文献[15]确定的功率(360 W)、温度(62 ℃)、料液比(1∶4 g/mL)、时间(20 min)下超声辅助提取,然后用布氏漏斗将提取液进行抽滤,并测定滤液中多酚的含量。

1.2.2 多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu比色法测定新疆红肉苹果中多酚的含量,参照文献[15-16],得没食子酸标准曲线回归方程为y=6.861x+0.0129,R2=0.9987(x的单位mg/mL)。吸取一定浓度的样品溶液,在760 nm处测定吸光值,以蒸馏水代替样品溶液作为空白对照,根据标准曲线回归方程确定浓度并计算出多酚的含量M。

M=N(C×V)/ m

其中,N-稀释倍数;C-多酚浓度,mg/mL;V-样品体积,mL;m-红肉苹果原料的质量,g;M-多酚的含量,mg/g。

1.2.3 新疆红肉苹果多酚的大孔吸附树脂纯化

1.2.3.1 大孔树脂的预处理 分别称取适量的5种不同大孔树脂(NKA-II、NKA-9、AB-8、D101、X-5),将其分别密封浸泡在95%的乙醇溶液中,活化48 h,用蒸馏水真空抽滤淋洗至乙醇完全洗净;然后分别用5% NaOH溶液和5% HCl溶液充分浸泡12 h,在酸、碱溶液浸泡前后都要用蒸馏水洗至中性,完全清洗干净后沥干水待用。

1.2.3.2 大孔树脂的筛选 分别测定5种大孔树脂对1.2.1中多酚提取液的吸附量与解析率,筛选出最佳树脂。

吸附量的测定：将5种预处理好的性质不同的大孔树脂(表1)分别称取4 g,放至5个100 mL的具塞锥形瓶中,每个锥形瓶中分别加入55 mL的新疆红肉苹果多酚提取液(浓度为0.8 mg/mL),避光密封,放在25 ℃的恒温振荡器中,以120 r/min的转速持续振荡24 h,然后测定上清液中剩余的多酚含量,根据公式(1)计算出各树脂的吸附量,从而对其吸附能力进行比较。

多酚吸附量Q=(C0-C1)×V1/M1

式(1)

式中：Q-多酚吸附量,mg/g;C0-吸附前溶液中新疆红肉苹果多酚的浓度,mg/mL;C1-吸附后溶液中新疆红肉苹果多酚的浓度,mg/mL;V1-吸附溶液的体积,mL;M1-大孔树脂的重量,g。

解析率的测定：将吸附饱和的大孔树脂进行抽滤,并分别用165 mL的去离子水对其进行清洗,然后用滤纸将树脂表面的水分吸干,再将其各自放入100 mL的具塞锥形瓶中,分别加入75%乙醇洗脱液55 mL,避光密封,继续在25 ℃恒温振荡器中,以120 r/min转速振荡24 h,然后测定上清液中多酚含量。根据以下公式(2)计算出树脂的解析率,从而其解析能力进行比较。

解析率D(%)=(C2×V2)/[(C0-C1)×V1]×100

式(2)

式中：D-解析率,%;C0-吸附前溶液中新疆红肉苹果多酚的浓度,mg/mL;C1-吸附后溶液中新疆红肉苹果多酚的浓度,mg/mL;C2-解析后溶液中新疆红肉苹果多酚的浓度,mg/mL;V1-吸附溶液的体积,mL;V2-解析溶液的体积,mL。

1.2.3.3 大孔树脂的静态吸附与解析动力学曲线 将预处理好的NKA-II树脂按照1.2.3.2中方法对新疆红肉苹果多酚进行吸附和解析试验,分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12和24 h时测定上清液中多酚的含量,分别绘制出NKA-II树脂的吸附和解析动力曲线。

1.2.3.4 大孔树脂动态吸附与解析试验 将预处理好的NKA-II树脂装入层析柱(1.3 cm×26 cm),在室温以及固定上样浓度0.8 mg/mL，上样流速4.0 BV/h，上样体积3.5 BV，乙醇浓度75%条件下，按照不同的上样浓度(0.4、0.8、1.2和1.6 mg/mL)、上样流速(2.0 、4.0、6.0 BV/h)、上样体积(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 BV)以及乙醇浓度(35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%)进行吸附,每隔一段时间测定其流出液中多酚的含量,其中固定上样浓度0.8 mg/mL、上样流速4.0 BV/h、上样体积3.5 BV、乙醇浓度75%。根据树脂使用说明书,当样品流出液的多酚浓度达到上样浓度的10%时,则停止吸附,此时为泄漏点。根据吸附量的大小以及泄漏点出现的快慢,从而确定最佳的吸附参数。待树脂吸附平衡后,用去离子水将杂质洗脱,再分别用相同体积的上述不同浓度乙醇洗脱剂以同样的流速进行洗脱,将所有的洗脱液收集,测定其中多酚的含量,并计算出解析率。根据解析率的大小,从而确定最佳的操作参数。

1.2.4 纯化后新疆红肉苹果多酚的组成分析 采用高效液相色谱(HPLC)[17-18]对纯化后的新疆红肉苹果多酚的物质成分进行分析。液相色谱条件：色谱柱Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm),柱温为35 ℃,检测波长为280 nm,流速为1.0 mL/min,进样量为20 μL,流动相A为50%甲醇和50%乙腈的混合液,流动相B为0.2%三氟乙酸水溶液,经过多次预实验确定的洗脱程序见表2。

表2 高效液相色谱的梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program of HPLC

1.2.5 新疆红肉苹果多酚的体外抗氧化活性

1.2.5.1 新疆红肉苹果多酚对DPPH自由基的清除作用 参照文献[12,16],分别吸取0.2 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆红肉苹果多酚至1.5 mL的离心管中,向其中加入0.6 mL的1 mmol/L DPPH乙醇溶液,将其混匀后,在室温下避光放30 min,然后测定在517 nm处的吸光值。分别以VC和蒸馏水代替多酚溶液作为阳性和阴性对照,以95%乙醇溶液代替DPPH溶液作为本底对照,再根据以下式(3)进行计算(A-新疆红肉苹果多酚溶液的吸光值;Ac-阴性对照组的吸光值;A0-本底的吸n光值)。

DPPH自由基清除率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(3)

1.2.5.2 新疆红肉苹果多酚对清除羟自由基的清除作用 参照文献[12,16],分别吸取0.2 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆红肉苹果多酚溶液至1.5 mL的离心管中,向其中依次加入6 mmol/L硫酸亚铁溶液、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和6 mmol/L过氧化氢溶液各1 mL,均匀混合后,放置37 ℃的水浴中避光静置1 h,然后测定在510 nm处的吸光值。分别以VC和蒸馏水代替多酚溶液作为阳性和阴性对照,同时再以蒸馏水代替过氧化氢溶液作为本底对照,再根据以下式(4)进行计算(A-新疆红肉苹果多酚溶液的吸光值;Ac-阴性对照组的吸光值;A0-本底的吸光值)。

羟基自由基清除率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(4)

1.2.5.3 新疆红肉苹果多酚对超氧阴离子的清除作用 参照文献[12,16],分别吸取NBT溶液和NADH溶液各0.25 mL至10 mL离心管中,再向其中加入0.25 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆红肉苹果多酚溶液,最后加入0.1 mLPMS溶液,混合均匀后,测定在560 nm处的吸光值。分别以VC和蒸馏水代替多酚溶液作为阳性和阴性对照,同时再以蒸馏水代替PMS溶液作为本底对照,再根据以下式(5)进行计算(A-新疆红肉苹果多酚溶液的吸光值;Ac-阴性对照组的吸光值;A0-本底的吸光值)。

超氧阴离子清除率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(5)

1.2.5.4 新疆红肉苹果多酚对脂质过氧化的抑制作用 参照文献[12,16],将20 mg卵磷脂溶于5 mL的磷酸缓冲液中(0.05 mol/L,pH=7.4),配制脂质体。分别取0.1 mL 0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%新疆红肉苹果多酚溶液和0.04 mL的脂质体加入1 mL离心管中,混匀,再向其加入0.01 mL FeSO4溶液(50 mmol/L),最后用磷酸缓冲液补足至总体积为0.6 mL。然后将其放入37 ℃水浴中,静置40 min,然后分别加入TBA(0.8%)和TCA(10%)各0.2 mL,放置100 ℃水浴中加热15 min,待其冷却后以5000 r/min离心10 min。测定上清液在532 nm处的吸光值。分别以VC和磷酸缓冲液代替多酚溶液作为阳性和阴性对照,同时再以磷酸缓冲液代替FeSO4溶液作为本底对照,再根据以下式(6)进行计算(A-新疆红肉苹果多酚溶液的吸光值;Ac-阴性对照组的吸光值;A0-本底的吸光值)。

脂质过氧化抑制率(%)=[Ac-(A-A0)]×100/Ac

式(6)

1.3 数据处理

利用Excel软件进行数据处理,同时利用SPSS 17.0数据处理软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 新疆红肉苹果多酚的树脂纯化

2.1.1 不同树脂对新疆红肉苹果多酚的吸附与解析能力的比较 由于不同种类的大孔树脂物理结构以及化学性质的不同,对于多酚的吸附与解析性能也不相同。试验所用5种不同类型大孔树脂对新疆红肉苹果多酚的吸附能力比较结果见图1a;不同大孔树脂对新疆红肉苹果多酚的解析效果见图1b。如图1a所示,5种不同的大孔树脂均可以吸附新疆红肉苹果多酚,但是NKA-II树脂吸附性能最好,吸附量达到(16.47±0.1150) mg/g,其次是AB-8树脂,吸附量为(15.66±0.0832) mg/g,吸附量最低的为D101树脂,吸附量仅为(14.43±0.1212) mg/g,各组之间差异极显著(p<0.01)。图1b结果显示了不同大孔树脂对新疆红肉苹果多酚的不同解析效果,可以看出NKA-II树脂的解析率最高,达到94.29%±2.14%,显著高于其他几种树脂。因此,根据大孔树脂对新疆红肉苹果多酚的吸附量和解析率的结果综合考虑,本试验选取吸附和解析能力最好的NKA-II树脂进行后续工艺优化试验。

图1 不同类型大孔树脂对新疆红肉苹果多酚的吸附与解析能力比较Fig.1 Comparison of adsorption and desorption capacity of different macroporous resins to the polyphenol from red-flesh apple of Xinjiang注：图1a:吸附能力，图1b：解析能力；不同大写字母表示各组之间差异极显著(p<0.01)。

2.1.2 NKA-II树脂的静态吸附与解析动力学曲线 NKA-II树脂的静态吸附与解析动力学曲线如图2a、2b所示。从图2a中可以看出,在0～6 h时,新疆红肉苹果多酚的吸附量快速上升,达到6 h时,然后趋于平缓。从图2b中可以看出,多酚解析率随着时间的增长明显上升,当到达10 h后,解析率变化不再明显,基本保持稳定。由此,可以得出,NKA-II树脂分别在6 h和10 h时对新疆红肉苹果多酚的吸附和解析达到平衡。

图2 NKA-II树脂静态吸附与解析新疆红肉苹果多酚的动力学曲线Fig.2 Static adsorption and desorption kinetics curve of NKA-II macroporous resin to the polyphenols from red-flesh apple of Xinjiang注：a为吸附动力学曲线，b为解析动力学曲线。

2.1.3 NKA-II树脂的动态吸附与解析试验

2.1.3.1 上样浓度的确定 从图3a中可以看出,当上样浓度分别为0.4、0.8、1.2和1.6 mg/mL时,它们的泄漏点分别出现在5、3.5、3和1.5 BV附近。当上样浓度为0.4 mg/mL时,泄漏点出现的时间过晚,不太适用于实际操作,而且上样时间过长,难免会造成多酚的氧化损失。但是当上样浓度为1.6 mg/mL时,泄漏点出现的过早,多酚的上样量会比较少,除此之外,多酚浓度过高,溶液的黏度会比较大,容易堵塞树脂,使其吸附性能降低。当上样浓度为0.8和1.2 mg/mL时,泄漏点出现时间适当,但是根据流出液多酚浓度和收集体积计算出前者的吸附量(96.30 mg)明显高于后者的吸附量(75.28 mg)。因此,综合泄漏点出现的时间以及吸附效果考虑,将新疆红肉苹果多酚的上样浓度确定为0.8 mg/mL。

图3 NKA-II树脂新疆红肉苹果多酚的动态吸附与解析试验结果Fig.3 Experimental results of dynamic adsorption and desorption of NKA-II macroporous resin to the polyphenols from red-flesh apple of Xinjiang注：a:上样浓度对NKA-II树脂吸附性能的影响;b:上样流速对NKA-II树脂吸附性能的影响;c:上样体积对NKA-II树脂吸附性能的影响;d:不同乙醇洗脱液浓度对NKA-II 树脂吸附的新疆红肉苹果多酚解析率的影响。

2.1.3.2 上样流速的确定 从图3b可看出当上样的流速为2.0 BV/h时,泄漏点在上样体积为7.0 BV左右出现,虽然计算出吸附量高达190.38 mg,但是泄漏点出现的过晚,上样的时间过长,效率太低。当上样的流速为6.0 BV/h时,泄漏点出现过早,在1.0 BV附近,计算出吸附量仅为27.50 mg,而且流速过快,也会导致多酚溶液没有时间与树脂接触,还没有完全吸附,便已经流出,从而使吸附率降低。当上样的流速为4.0 BV/h时,泄漏点出现时间合适,在3.5 BV左右,吸附量也较高,达到97.70 mg。因此,根据纯化效率和成本综合考虑,上样流速选择4.0 BV/h最佳。

2.1.3.3 上样体积的确定 从图3c中可以看出,从0 BV开始,上样体积增大,流出液中多酚的浓度逐渐呈现的是逐渐上升的趋势,当上样体积为3.5 BV时,达到泄漏点,流出液中多酚的浓度为0.08 mg/mL,但是继续增大上样体积,流出液中多酚浓度也会继续增大,吸附量会随之降低。因此,上样体积选择3.5 BV最佳。

2.1.3.4 洗脱液浓度的确定 一般情况下,多酚类物质在乙醇、甲醇、丙酮等极性溶剂中解析率均很高,具有较好的洗脱效果,其中乙醇作为解析剂,价廉易得、安全无毒性。因此,选用乙醇溶液作为洗脱剂,从图3d可以看出,从乙醇洗脱液浓度为35%开始,多酚解析率逐渐增大,当浓度达到75%时,达到最大解吸率,为96.56%,但随后解析率随乙醇浓度的增大而降低。因此,综合考虑,乙醇洗脱液浓度选择75%最佳。

2.2 纯化后新疆红肉苹果多酚的组成成分分析

纯化后新疆红肉苹果多酚组成成分的HPLC色谱图见图4a,图4b为同等色谱条件下16种多酚标品混合溶液的HPLC色谱图。

由图4a、图5b根据单酚出峰的位置进行分析,可知新疆红肉苹果多酚中主要检测出了10种单酚类物质,各成分的具体含量见表3,从表中可以看出,新疆红肉苹果多酚中含量最高的为绿原酸,含有(123.15±4.34) μg/mL,其次是槲皮苷和原花青素B2。根据文献[19-20]可知,和其它白肉苹果中多酚相比,新疆红肉苹果多酚中绿原酸和原花青素B2含量相对较高,儿茶素含量较低。

图4 纯化后新疆红肉苹果多酚与多酚标准品的HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of red-flesh apple polyphenols after purification and polyphenols stanfards注：a:苹果多酚HPLC色谱图;b:多酚标准品的HPLC色谱图;1-原儿茶酸;2-表没食子儿茶素;3-儿茶素;4-原花青素B2;5-绿原酸;6-对羟基苯甲酸;7-芦丁;8-金丝桃苷;9-槲皮苷;10-槲皮素。

表3 纯化后新疆红肉苹果多酚的单体酚种类及含量Table 3 Composition and content of individual phenolic compounds in red-flesh apple polyphenols after purification

2.3 新疆红肉苹果多酚的抗氧化活性

2.3.1 新疆红肉苹果多酚对DPPH自由基的清除作用 新疆红肉苹果多酚对DPPH自由基的清除作用如图5a所示。从图5a中可以看出,新疆红肉苹果多酚和VC对DPPH自由基均具有明显的清除作用,并且随着剂量浓度的增大而增大。当浓度为0.1 mg/mL时,二者的清除率分别高达93.99%和98.23%,随后浓度增大,清除率变化不明显,趋于稳定。试验显示,新疆红肉苹果多酚对DPPH自由基的清除作用稍弱于VC,可能是因为多酚的纯度比VC低。

2.3.2 新疆红肉苹果多酚对羟基自由基的清除作用 按照1.2.5.2的方法进行试验,新疆红肉苹果多酚对羟基自由基的清除作用如图5b所示。从图5b可以看出VC和新疆红肉苹果多酚对羟基自由基均具有很强的清除作用,且清除率随着浓度的增大而升高,表现出显著的剂量依赖性。当浓度为0.8 mg/mL时,二者趋于稳定,清除率基本相同,均达到99%以上。当浓度小于0.2 mg/mL时,新疆红肉苹果多酚的清除率甚至要高于VC。

2.3.3 新疆红肉苹果多酚对超氧阴离子的清除作用 按照1.2.5.3的方法进行试验,新疆红肉苹果多酚对超氧阴离子的清除作用如图5c所示。多酚和VC一样可以清除NADH与NBT反应产生的超氧阴离子,从而减少超氧阴离子与PMS反应产生的显色物质,使得溶液的吸光值发生改变。从图5c中可以看出,VC和新疆红肉苹果多酚对超氧阴离子具有很强的清除能力,且浓度和清除率呈正相关,表现出显著的剂量依赖性,随后逐渐趋于稳定。浓度较低时,同等浓度下新疆红肉苹果多酚的清除率略强于VC,当达到0.4 mg/mL时,二者清除超氧阴离子的能力基本相当,均达到98%以上。

2.3.4 新疆红肉苹果多酚对脂质过氧化的抑制作用 多酚对脂质过氧化的抑制作用试验结果如图5d所示。从图5d可以看出,VC和新疆红肉苹果多酚对脂质的过氧化均具有较强的抑制作用,并且两者均表现出剂量依赖性,即随着浓度的升高,抑制作用显著增强。在浓度为0.2 mg/mL时,VC的清除率逐渐趋于稳定,多酚浓度达到0.6 mg/mL时,多酚的清除率也趋于稳定,最终二者的清除作用逐渐相近,分别达到96.65%和93.75%。

图5 新疆红肉苹果多酚的抗氧化活性试验结果Fig.5 The antioxidant activity test results of polyphenols from red-flesh apple of Xinjiang注：a:新疆红肉苹果多酚对DPPH自由基的清除率;b:新疆红肉苹果多酚对羟基自由基的清除率;c:新疆红肉苹果多酚对超氧阴离子的清除;d:新疆红肉苹果多酚对脂质过氧化的抑制率。

3 讨论

前人研究[23-25]发现AB-8型树脂纯化嘎啦苹果多酚的效果较好,且对葡萄籽多酚有良好纯化作用,D101树脂对石榴皮多酚的有较强的吸附作用,HZ2806大孔树脂纯化茶树花多酚其纯度提高快,樟子松松塔多酚用D4020大孔树脂纯化效果好,而本试验发现NKA-II树脂红肉苹果多酚的吸附和解析都比较好,说明不同来源的多酚由于组成的差异其适于纯化的树脂也不同。因为不同型号的大孔树脂孔径和结构差异大,能与不同的多酚成分形成分子间作用力,从而达到吸附分离的作用。尽管本试验通过优化多酚纯化条件,使红肉苹果多酚的纯度达到84%能满足商业应用的要求,但是对于深入评价红肉苹果多酚的细胞活性而言,其纯度还不够。其次是试验已经明确红肉苹果多酚中的主要10个成分,且体外抗氧化试验虽已说明新疆红肉苹果多酚具有很好的抗氧化活性,但是红肉苹果多酚是否能增强体内抗氧化酶系统活性、提高机体抗氧化的能力等方法,还需要继续进行体内抗氧化试验(动物实验)加以确定,这对于开发具有减少体内氧化损伤、延缓细胞衰老、预防许多慢性病的功能食品具有重要意义。

4 结论

通过比较5种不同的大孔树脂选取了吸附和解析性能好的NKA-II树脂对新疆红肉苹果多酚进行纯化,该树脂分别在6和10 h达到静态吸附和解析平衡;NKA-II树脂纯化多酚的动态最优工艺为：上样浓度0.8 mg/mL,上样流速4.0 BV/h,上样体积3.5 BV,洗脱液乙醇的浓度75%。在此条件下,纯化后的新疆红肉苹果多酚其纯度由35%提高至84%。

利用高效液相色谱分析纯化后的新疆红肉苹果多酚,可知主要含有10种单酚类物质,分别为原儿茶酸、表没食子儿茶素、儿茶素 、原花青素B2、绿原酸、对羟基苯甲酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷和槲皮素。其中绿原酸的含量最高,为123.15 μg/mL,其次是槲皮苷和原花青素B2,分别是25.28和21.96 μg/mL。

新疆红肉苹果多酚对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子具有明显的清除作用,清除率与相同浓度的VC的清除率接近或高于VC,且对脂质过氧化具有抑制作用,说明新疆红肉苹果多酚具有显著的抗氧化功效。新疆红肉苹果多酚是一种潜在的天然抗氧化活性的功能食品基料,值得深入开发利用。