教学用草履虫碳酸银染色方法的改进*

温砚子 张 平 黄建荣

（中山大学生命科学学院 广东广州 510275）

草履虫（Paramecium）是原生动物门纤毛纲的代表物种，具有易分离、易培养的特点，是生物学实验教学常用的实验材料。碳酸银染色是一种被广泛应用于纤毛虫分类学、细胞遗传学、发育生物学和细胞毒理学等研究领域的技术。该染色方法主要是基于Fernandez-Galiano提出的试剂配方和操作流程而进行设计［1-2］。碳酸银染色法可以清晰染色草履虫的细胞核、表面纤毛基粒和皮下纤维系统；与其他常用的纤毛虫染色方法相比，具有步骤简单、用时少的特点，因此利用碳酸银染色显示草履虫的结构在实验教学中被广泛采用［3］。但是传统的碳酸银染色方法在草履虫染色实验教学中效果常常不稳定，例如，样品液、固定液和染色液加样是通过计算滴管的液滴数依比例混合，不同学生对滴管的使用力度有偏差，导致染色效果参差不一，有些学生甚至多次操作也不能让草履虫成功着色。另外，传统的染色流程是根据目测反应液变成“棕色”或“巧克力色”而终止反应，这种描述性的判断对于初学者来说很难准确把握，着色太浅或太深的情况在课堂中很常见，妨碍后续对草履虫微观结构的观察，影响正常教学进程。同时，传统方法多采用加入硫代硫酸钠终止染色反应，而在课堂中常见学生在镜检后才发现草履虫染色不够，却因加入硫代硫酸钠后不能让反应液再进一步加热染色，导致学生不断重复操作，无法在有限的课堂时间内完成实验。本文针对草履虫碳酸银染色实验教学中发生的常见问题进行探索，优化了染色配方、细化了操作流程，使其更适用于教学。

1 材料和方法

1.1 实验材料

试剂：硝酸银、碳酸钠、氨水、吡啶、蒸馏水、甲醛、草履虫分离液或草履虫培养液。

器材：天平、烧杯、量筒、玻璃棒、移液器（100 ～1 000 μL）及吸头、5 mL 玻璃试管和水浴锅。

1.2 实验方法

1）染色液配制（教师准备）：染液现配现用。

①Rio-Hortega碳酸银溶液：5 mL 10%硝酸银溶液+15 mL 5%碳酸钠溶液，混匀后逐滴加入氨水至沉淀完全溶解，蒸馏水稀释至75 mL；

②Fernandez-Galiano染色液 （不加蛋白胨）：75 mL Rio-Hortega溶液+37.5 mL吡啶混合，蒸馏水稀释至537.5 mL。

2）草履虫碳酸银染色（学生操作）：

①用移液器加入 200 μL草履虫培养液于5 mL玻璃试管中，随后加入200 μL 4%甲醛固定，轻摇混匀后静置1 min；

②加入200 μL已配置好的Fernandez-Galiano染色液，轻摇混匀；

③60℃水浴3 min，在此过程中轻摇试管保证染色均匀；

④加入200 μL冷蒸馏水，终止反应；

⑤吸取虫体镜检，为保证观察效果，尽量在反应结束后60 min内取样镜检。

2 操作步骤注意事项和说明

2.1 染色液配制注意事项 由于硝酸银等试剂化学性质不稳定，长时间保存容易变质，因此在染液配置前务必要确保所用试剂未变性。传统的Fernandez-Galiano染液有添加蛋白胨，而本研究发现不添加蛋白胨的染液在保证细胞核、纤毛基粒等结构被清晰染色的情况下，更不容易产生过度染色（图1），更适用于实验教学环境，所以改良的染液中不再添加蛋白胨。

图1 草履虫经Fernandez-Galiano染液染色

2.2 实验操作注意事项

1）为了避免因使用滴管力度不均而造成的染色效果失败，改用移液器对加样体积进行准确定量，确保每个学生在有限的课堂教学时间内能将草履虫成功染色。

2）传统的操作方法是利用反应液的颜色进行主观判断决定是否终止反应，这对于初学者而言很难准确把握，课堂中大部分学生都会出现染色不够或染色过深的情况。经过反复实验探索，发现依照所改良的试剂配方和操作步骤，反应3 min即可得到最佳的染色效果。

3）由于教学实验结果无需长久保存，建议用冷蒸馏水替代硫代硫酸钠进行终止反应。与化学终止法不同，冷却终止反应法只是通过降低温度终止反应，反应液中的化学试剂仍未变性，因此在发现草履虫着色不充分的情况下，再次加热反应仍然可让草履虫着色加深，避免学生在有限的课堂时间内重复操作。但是，这种非化学变性的方法存在不能让反应彻底终止的缺陷，为避免长久放置导致染色过深，应在反应结束后60 min内取样观察。

3 总结

基于Fernandez-Galiano染液的碳酸银染色方法，可清晰显示草履虫的纤毛图式。由于传统配方和操作方法在课堂教学应用中表现不稳定，影响了教学效果，因此在本研究中，通过修改染色液配方、细化实验操作步骤以获得更好的染色效果，保证实验教学质量。该方法目前在课堂教学中已获得良好的效果。