中职“纳豆芽孢杆菌发酵纳豆制品”实验教学*

祁惠芳 程子良 牛亚胜 孔维宝**

（1西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070 2天水农业学校 甘肃天水 741400）

1 实验设计思路

近年来，涉农类中职学校为突出学生的实训操作，开设了《生物应用技术》课程，该课程以就业为导向，注重学生技术技能的培养。然而，目前大多数学校使用的教材，均参考以义务教育为基础的教材，涉及的实验内容大多以生物学基础研究为主，例如显微镜观察细胞结构、探究光合作用条件、观察玉米糯性和非糯性花粉粒遇碘的颜色变化实验等，未能体现与职业教育导向相关的应用知识的学习。因此，教学内容与实际生活脱轨，导致中职学生这一特殊群体对学习的生物学兴趣不高。

为了在教学中让中职学生掌握扎实的微生物学无菌操作知识，且与未来就业接轨，笔者以“纳豆芽孢杆菌发酵纳豆制品”实验作为教学内容，提高学生学习《生物应用技术》课程的兴趣，巧妙地使学生掌握原本枯燥的无菌操作、培养基制作、菌种活化、发酵制品制作等相关的理论知识和实践技能，增加学习过程的趣味性。该实验以纳豆为原材料，绿色环保、容易获取、营养丰富，且实验过程操作简单、可操作性强、易于学生掌握。发酵后的产品可将大豆中不溶解性蛋白转变为可溶性蛋白并产生氨基酸，同时成品具有预防肠道疾病、骨质疏松及溶胶血栓的作用［1］。

教育与实践行动相结合，既能激发中职学生的实验兴趣，真正做到在“做事里求学问”［2］，又能让学生获得成就感与满足感。中职学校的核心任务是培养满足社会发展和企业需求的专业化应用型技能人才。学习纳豆的制作方法其实是掌握了一项职业技能，可增加学生未来就业竞争力，一定程度上缓解中职学校重理论教学、轻实践操作的问题，真正掌握生产实践过程中所需的专业职业技能。因此，本实验是中职学生实验教学的理想内容之一。

2 实验教学内容

本次实验教学分4课时完成。课程开始前，教师根据全班学生情况进行分组，每组6人，小组成员各自擅长之处不同，组内不设置小组长，完成任务靠小组成员共同讨论。教师给各小组分发实验流程单和实验报告单。第1课时：纳豆成品展示与芽孢杆菌菌种活化实验。教师展示成品纳豆并让学生品尝，指导学生进行菌种活化实验；主要目的是使学生掌握无菌操作技术、培养基和种子液的制作方法；这部分实验步骤较多，对学生的操作细节的要求较严格，要求各小组学生对实验操作进行录像，用于后续讨论。第2课时：制作纳豆。主要目的是培养学生专业职业技能，在纳豆制作的过程中加深对生物基本操作的认识，掌握纳豆制作工艺。第3课时：纳豆成品的感官评定与理化指标检验。主要目的是判断学生制作的纳豆是否达到SB／T 10528-2009纳豆商业标准，是否可食用。第4课时，成果展示并全班评价。各小组学生展示成果和播放录像，讲解实验细节和目的。

2.1 实验材料与仪器

1）材料与试剂：黄豆、纳豆芽孢杆菌（Bacillusnatto）、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、0.01 mol／L 和6 mol／L NaOH、0.01 mol／L 和 6 mol／L HCl、海沙。

2）仪器与器具：PYL-45恒温水浴锅、高速离心机、恒温振荡器、SW-CJ-2FD超净台、YXQLS-7 5SII立式蒸汽灭菌锅、冰箱、移液器、真空干燥箱、pH试纸、培养皿、试管、三角瓶。

2.2 实验操作流程 本次实验操作流程主要分为3个部分：第1部分，纳豆芽孢杆菌菌种活化与种子液的制备；第2部分，纳豆的制作过程（图1）；第3部分，纳豆成品的感官评定及理化指标测定。

表 1 感官评定［5］与理化指标标准［6］

图1 纳豆的制作流程

2.2.1 纳豆芽孢杆菌种活化 按照培养基的配方配制培养基：蛋白胨 1%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、葡萄糖 0.5%、酵母膏 0.5%、琼脂粉 1.8%（以上均为质量分数）［3］。待培养基灭菌并冷却至42℃时，倒平板；将保存的纳豆芽孢杆菌接种至培养基中。纳豆芽孢杆菌活化完成后，使用接种环刮下菌孢并用无菌水冲洗，接入装有一定量液体培养基的试管中；在30℃条件下，180 r／min摇床培养24 h制得种子液。

2.2.2 纳豆成品制作 将大豆清洗干净后，用水浸泡8～15 h，直至大豆体积膨胀为原来的2倍。将泡好的大豆在121°C条件下，进行高温高压灭菌15 min，大豆在手中可捏碎为最佳；然后在无菌环境下将灭菌的大豆移入发酵笼屉中冷却，冷却时表面需覆一层纱布；冷却至室温后，将准备好的种子液按8%～10%接种量淋至大豆表面，用无菌铲搅拌均匀；将接种的大豆置于42℃恒温培养箱培养15～18 h，进行发酵。发酵完成后，揭去笼屉表面的纱布，豆子将呈现灰白色，略有纳豆的清香；最后将发酵的纳豆置于4℃的冰箱中后熟24 h。

2.2.3 纳豆成品感官评定和理化指标测定

1）感官评定。表1所示的是现行有效的SB／T 10528-2009对纳豆的感官评定标准；使用目测、口尝及嗅觉等方式对纳豆制品进行感官评定；学生以小组为单位分别对不同组别的成品进行打分，判断是否符合标准［4］（表 1）。

2）理化指标测定。

水分测定：按照GB／T 5009.3要求，利用减压干燥法，使用已恒重的称量瓶称取10 g试样并用刀片切碎，置于真空干燥箱内，干燥箱连接水泵。将干燥箱的空气抽出，压力控制在40～53 kPa，温度加热至（60±5）℃。关闭真空泵上的活塞，停止抽气，经4 h后，打开活塞使空气缓缓进入干燥箱，待压力恢复正常后再打开，取出称量瓶，放入干燥器0.5 h后称量，重复以上操作至恒重。按照下述公式计算水分含量，含量；m1：称量瓶和试样的质量；m2：称量瓶和试样干燥后的质量；m3：称量瓶的质量），结果与表1的标准范围进行比较，判断是否符合食用要求［5］。

氨基酸态氮：按照GB／T 5009.39要求，利用甲醛值法测定氨基酸态氮值。将样品粉碎研磨后吸取5 mL试样于100 mL容量瓶中定容；混匀后吸取20 mL至于200 mL烧杯中，加60 mL水，开动磁力搅拌器，用0.05 mol／L NaOH滴定至酸度计指示pH值为8.2，记录NaOH滴定体积；然后加入10 mL甲醛溶液混匀，继续用 0.05 mol／L NaOH滴定至酸度计指示pH值为9.2，记录消耗的 NaOH 体积；取 80 mL水，用 0.05 mol／L NaOH调节pH值为9.2，同时做试剂空白对照。使用下述公式计算氨基酸态氮，100%（X：试样中氨基酸态氮含量；V1：试样稀释液消耗NaOH的滴定体积；V2：空白试验消耗NaOH的滴定体积；V3：试样稀释液取用量；c：NaOH标准滴定溶液浓度）。计算结果与表1进行比较，判断是否符合标准［6］。

2.2.4 实验操作要点

1）蛋白胨易吸收水份，在称量时用玻璃棒快速挑取，用热水搅拌融化后放入烧杯。

2）每次调节较小幅度的pH值，以免回调影响培养基内的离子浓度，直至pH值范围控制在7.4～7.6内。

3）使用蒸汽灭菌锅将制作好的培养基在压强0.1 MPa、温度121℃条件下，灭菌20 min。

4）种子液接种至大豆表面时，一定要在无菌环境下操作，防止杂菌污染。

5）浸泡大豆时，每隔3 h更换浸泡水，防止大豆进行无氧呼吸产生酸味。

6）大豆的蒸煮程度以用手可轻轻捏碎为最佳。研究表明，随着碾碎程度的加大，氨基酸态氮和粘多糖含量显著增加［7］，可使大豆发酵更加充分。

7）将种子液接种至大豆后，在 42℃下发酵15～18 h，然后4℃后熟24 h。若过度发酵，会破坏纳豆芽孢杆菌结构，且容易引起其他杂菌滋生。

2.3 实验报告单 教师将实验原理设计成探究性问题，并制作实验报告单分发给学生，待实验完成后进行回收。旨在培养学生独立思考的能力，学生通过实验操作与现象观察，明白实验原理和理解实验操作要点。实验报告单如表2所示。

表2 “纳豆芽孢杆菌发酵纳豆制品”实验报告单

2.4 实验结果讨论 整个实验流程较简单，只要严格遵照操作步骤，注意实验操作的关键环节进行实验操作即可，全程一定要明确无菌操作意识。学生针对自己小组出现的问题认真思考，展开讨论，部分小组制作的纳豆成品由于制作过程中杂菌滋生导致氨味过于强烈；有些小组制作的纳豆有恶臭味，主要原因是在大豆浸泡过程中没有及时更换浸泡水；个别小组的成品虽然表面粘稠品相很好，但口味略发苦，导致这种不良气味产生的原因主要是大豆在发酵时透气性不好，因此发酵时一定要在保证适宜湿度的前提下合理通风。

3 实验教学总结

本次实验的灵感来自于中职 《生物应用技术》，实验利用纳豆芽孢杆菌制作纳豆，培养学生学习生物学实验的兴趣，锻炼专业职业技能。该实验使学生初步了解并学习了无菌操作技术、微生物纯化、培养基制备、种子液配制、发酵条件控制、产品质量检测等实验技术，同时让学生掌握纳豆的制作工艺，为后续开展生物学应用技术课程的学习奠定基础。

生物学是一门实验科学，对学生的实验技能要求较高，实验教学方式不应该是教师 “讲解”，学生被动“接受”［3］。第4课时加入视频展示和评价环节，其实是让学生在“做中学”，观看自己的实验，可清楚地看到实验中错误的操作。微生物操作技术对于实验操作要求十分严格，每个操作要点都应该熟记于心，不小心杂菌侵染可能会导致整个实验失败，因此教师和全体学生共同评价，有助于学生对实验细节的把控更加完善，扎实掌握微生物实践技能。然而，单纯地掌握技能是不够的，还需要学生在工作实践中灵活应用，不断强化职业技能，为未来的就业提升竞争力。当下将微生物应用在食品、制药和生物领域十分广泛，本节实验就是微生物在食品行业的应用，教学开始时让学生品尝纳豆成品，从味道微甜、口感粘稠的纳豆中激发学生的求知欲，纳豆为什么表面会抽丝？味道为什么会发甜？什么菌种发酵才能达到这种效果？充分发挥学生的自主性、主动性和创造性，在学习知识、掌握职业技能的同时，培养学生的生物学学科核心素养。