酶的制备与分析

姜联合 编译

（中国科学院植物研究所 北京 100093）

酶类是所有生物体自然产生的一种蛋白质。作为催化剂，它们能将大的复杂的结合物分解为较小的因子，从而在机体中更易被利用。同样，大量的复合物需要小分子酶类来分解。日常所知的洗衣液、胰岛素等都是酶类的一种，食品、药品、化妆品都有酶的影子。酶是怎样产生的？又有哪些类别，都应用在何处？一起来制作一个生物反应器，学习检测分析酶类的方法。

1 背景知识

根据酶类分解的物质对酶进行分类。例如，纤维素酶能将纤维素分解为单糖；蛋白酶是一种能将明胶这类物质分解的酶类；过氧化氢酶能分解过氧化氢：H2O2→2H2O+O2。

当处于合适的温度和pH值时，酶类才具有活性。可根据这些特点考虑酶类是否能运用在商业中。商业上使用的酶类都是从生物反应器中的细菌和真菌体内分离得到的。

生物反应器是能繁殖大量微生物、生产所需产物的大容器。所需产物可以是医药行业所需的蛋白质，例如糖尿病患者所需的胰岛素；也可以是工业上所需要，用于软化纸张、制作奶酪，或者是让蓝色牛仔服褪色；也可能是家庭所需的如用于软化肉类的蛋白质酶和洗衣液。生物反应器必须包括以下条件：首先，必须能被完全灭菌；其次，能提供一个微生物繁殖并产生大量代谢产物的环境；有一个进气口、一个排气口、一个加样口，以及一个安置测量电极的路径。影响生物反应器效率的因素包括：培养物的纯度、使用的介质、温度、pH值、溶氧量和二氧化碳含量。

2 实验目的

1）描述能影响微生物生长和代谢产物成分的因子；

2）掌握检测现有酶类的方法。

3 装备生物反应

3.1 实验材料 卫生纸、5 L 10%消毒液、5 L桶；1.25 L饮料瓶（空的且洁净）、玻璃棒或钝探针、酒精灯、1 m洁净的水管、气石、锋利的剪刀或刀片、硅胶塞、15 L无菌水、橡皮圈、大纸夹镊子、烧杯、液体酒精、装在密封瓶子里的消毒棉（用铝箔纸封口，在160℃烘箱中灭菌2 h）、空气泵。

3.2 实验步骤

1）用卫生纸蘸取稀释的消毒剂，擦拭实验台；

2）用酒精灯加热钝探针或玻璃棒的一端，在饮料瓶的上端打3个等距的孔，每个孔将安装干净的水管；

3）用剪刀或刀片将水管切成以下长度：排气管12 cm、上样管30 cm、充气管50 cm；

4）将每个水管插到对应的孔中（图1）：排气管应将一半以上插入瓶中，上样管应插入到接近却不碰到瓶底，充气管应该接触到瓶底；

图1

5）将接通空气的管子与充气管的末端接在一起；

6）用硅胶塞将管口密封，可用橡胶圈将管子固定；放置 24～48 h；

7）带上手套；

8）用卫生纸蘸取稀释的消毒剂，擦拭实验台；

9）在烧杯中加入液体酒精，并将镊子浸没其中；

10）将桶里加入10%消毒液，将瓶子和瓶盖浸没在其中至少10 min；

11）倒掉消毒液；

12）用冷的无菌水冲洗3次；

13）盖上瓶盖，用夹子夹住折过来的上样管达到密封效果；

14）用灭菌的镊子将消毒棉轻轻塞入进排气管和充气管的末端，并将充气管与空气泵连接。

4 生物反应器接种

4.1 实验材料 天平、2个称量盘、15 g糖、1 g酵母膏、350 mL蒸馏水、加热板、400 mL带塞子的锥形瓶、漏斗、1 L 10%消毒液、3 L无菌水；pH试纸或者 pH 计、0.1 mol／L HCl、1 袋（7 g）活性酵母（酿酒酵母）。

4.2 实验步骤

15）用卫生纸蘸取稀释的消毒剂，擦拭实验台；

16）将350 mL蒸馏水加入锥形瓶；

17）用天平称取糖与酵母膏；

18）将糖和酵母膏加入锥形瓶并加热至沸腾；

19）测量溶液的pH值，如果高于5.4，就慢慢加入盐酸让pH值降至5.4；

20）煮沸15 min，然后盖上盖子，冷却；

21）用桶中稀释的消毒液将漏斗消毒，然后用无菌水清洗3次；

22）快速打开瓶盖，将漏斗插入，将肉汤灌入生物反应器；

23）盖上盖子并开始充气，这便能产生一个正压，使得其他的微生物很难进入；

24）再次将盖子打开，插入漏斗，并加入一袋酵母粉；

25）将盖子盖紧。

5 分析酶的产量

5.1 实验材料 10 mL注射器、消毒棉、3% 过氧化氢液、移液管、带盖子的瓶子（比微量离心管大的）、2个显微镜载玻片、1个盖玻片、微量离心管、秒表或计时器、在培养皿中倒入5 mm厚的含有红色食用色素的明胶、滴管、2根试管、试管架、将0.33 g肉类软化剂溶解在10 mL水中、透射光学显微镜（物镜放大倍数为40倍）、100 mL 10%消毒液、100 mL量筒。

5.2 实验步骤 分析从接种的当天及其后3 d分别进行。必须每天搅拌样品数次。

26）打开上样管的夹子，接上10 mL注射器并抽取大约3 mL发酵液弃去；

27）抽取10 mL发酵液。夹上夹子，取下注射器并塞上消毒棉。

6 过氧化氢酶分析

28）向微量离心管中加入0.5 mL发酵液；

29）加入0.5 mL 3%的过氧化氢溶液；

30）立刻盖上离心管的盖子然后置于一个带有盖子的容器中；

31）如果产生大量的气泡，则说明含有过氧化氢酶；

32）记录下从开始到产气量达到最高的时间，如果超过半小时即可停止分析；

33）将用过的离心管放入装有消毒液的桶中。

7 蛋白酶分析

34）用吸管从含有明胶的培养皿中取适量明胶放入一根试管中；

35）重复上述操作，将明胶放入第2根试管；

36）在第1根试管中加入1 mL发酵液；

37）在第2根试管中加入1 mL肉汤；

38）记录溶解明胶块所需的时间；

39）将用过的试管放在装有消毒液的桶中。

8 显微镜观察

40）在载玻片上滴1～2滴培养物，盖上盖玻片；

41）将用过的注射器放入装有消毒液的桶中；

42）调节透射显微镜至低倍镜；

43）将载玻片放在显微镜载物台上，画下并标记出所观察到的；

44）调节显微镜至高倍镜，画下并标记出所观察到的；

45）将用过的玻片放在装有消毒液的桶中。

9 思考题

1）微生物在需氧的液体环境中生长需要哪些必要的条件？（提供氧气和搅拌。）

2）为什么在厌氧环境微生物不能产生酶类？（酶的产生是依赖ATP的合成代谢途径，而氧气形成是合成酶所需ATP的前提。）

3）举例说明微生物产生的酶类和蛋白质在工业上的应用。（答案不唯一，在背景知识中提到过。）

10 现实生活中生物反应器的应用

生产酶类：酶类被广泛用于食品行业、制造业、制药业和家庭使用的化学物品中。