微小RNA-373表达下调对皮肤鳞状细胞癌A431细胞周期和凋亡的影响

夏永华 张彩凤 李敏 刘冬 胡华 张孟杰 程赛

1新乡医学院第一附属医院皮肤科，河南卫辉453100；2新乡医学院第一附属医院消化内科，河南卫辉453100

miRNA-373（miR-373）定位于人类染色体 19q13.4，最初被鉴定为人胚胎干细胞特异性miRNA分子之一［1］。随后研究表明，miRNA-373 的转入能使正常细胞大量增殖并形成肿瘤，且具有癌性大鼠肉瘤病毒癌基因同源基因（rat sarcoma viral oncogene homolog gene，RAS）的特点，被证实为潜在的癌基因［2］。进一步研究显示，miR-373与食管鳞状细胞癌（简称鳞癌）［3］、宫颈癌［4］、乳腺癌［5］和非小细胞肺癌［6］等多种不同的肿瘤发生发展密切相关。我们前期研究发现miR-373 表达下调显著抑制皮肤鳞癌A431 细胞的侵袭，并能显著下调基质金属蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9蛋白的表达［7］。为进一步研究miR-373在皮肤鳞癌中的作用，我们采用miR-373抑制剂下调皮肤鳞癌细胞中miR-373的表达，探讨其对细胞周期和凋亡的影响，初步探讨可能的分子机制，为以miR-373为靶点的皮肤鳞癌的靶向治疗提供依据。

一、材料与方法

1.细胞及试剂、仪器：皮肤鳞癌细胞株（A431）来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。miR-373抑制剂（即miR-373互补序列ACACCCCAAAATCGAAGCACTTC）以及阴性对照miRNA为上海吉玛公司产品；脂质体2000转染试剂产自美国Invitrogen 公司；胎牛血清产自美国Gibco公司；实时PCR试剂盒和逆转录试剂盒均来自北京天根生化科技有限公司；胱天蛋白酶3（caspase-3）检测试剂盒来自美国Sigma 公司；流式细胞仪为美国Beckman 公司产品；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭均为美国Sigma公司产品。

2.细胞培养、转染及分组：用含10%胎牛血清、100 U/ml链霉素和青霉素的DMEM培养液在37 ℃、5%CO2环境中传代培养A431细胞。细胞处于对数生长期时，采用胰酶消化，计数后接种至6 孔板进行后续实验。将细胞分为3 组：未处理组不接受任何处理，阴性对照组转染阴性对照miRNA，miR-373抑制剂组转染miR-373抑制剂。按照脂质体2000的说明操作，于转染后48 h进行后续实验。

3.实时PCR检测细胞中miR-373基因表达：用Trizol试剂提取各组A431 细胞的总RNA，利用miR-373 和U6 反转录引物按操作说明进行逆转录。miR-373 反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTG GATACGACACACCC - 3′ ，U6 反 转 录 引 物 5′ -GTCGTATCCAG TGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAATA-3′，均由上海吉凯生物公司合成。按实时PCR 试剂盒说明书扩增细胞中miR-373 基因，并以U6 基因作为内参。hsamiR-373-3p正向引物5′-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反向引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物 5′ -CGCT TCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△△Ct计算miR-373的相对表达量。

4.CCK-8 检测细胞增殖：将3 组A431 细胞制备成单细胞悬液，分别接种于96孔板中（3 000个细胞/孔），每个时间点设置 5 个复孔，分别于培养 24、48、72 和 96 h 时在上述培养孔中加入终浓度为10%的CCK-8试剂，于37 ℃培养箱中继续孵育2 h，最后利用酶标仪测定450 nm 波长处吸光度（A值），并绘制肿瘤细胞的生长曲线。

5.细胞周期分析：转染后48 h收集A431细胞，每组1×106个。离心后用预冷的PBS 漂洗3 次，采用70%冰乙醇于4 ℃固定30 min，结束后用预冷的PBS漂洗3次，将细胞重悬于含40 μg碘化丙锭和100 μg RNaseA的PBS中，于37 ℃孵育30 min。最后采用流式细胞仪检测10 000 个细胞，分析DNA含量。

6.细胞凋亡检测：收集转染后48 h 的细胞，2 000 r/min（离心半径1.4 cm）离心5 min，用预冷PBS 漂洗，计数，按1 × 106/ml 重悬，取100 μl 细胞放置于流式管中，分别加入5 μl 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙锭，避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测10 000 个细胞，最后通过CellQuest软件分析凋亡率。

7.比色法检测caspase-3活性：分别将3组A431细胞悬液接种至 96 孔板中，每孔 100 μl（3 × 103个细胞），置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞转染后48 h，根据试剂盒说明加5 μl 5 mg/L caspase-3 酶底物至上述各组培养基中，37 ℃孵育1 h。酶标仪测定A450值，以此表示caspase-3活性。

二、结果

1.miR-373抑制剂显著下调A431细胞中miR-373的表达：实时PCR 检测表明，miR-373 抑制剂组miR-373 的表达水平为0.120±0.036，显著低于未处理组（1.002±0.022）和阴性对照组（1.037 ± 0.028），且差异有统计学意义（F=376.565，P＜ 0.001；t值分别为36.21、34.83，均P＜ 0.001）；未处理组和阴性对照组之间差异无统计学意义（t=1.702，P=0.164）。

2.miR-373 表达下调抑制A431 细胞增殖：与未处理组和阴性对照组相比，miR-373抑制剂组在48、72和96 h时细胞增殖活性显著降低，且3 组间差异均有统计学意义（F值分别为10.805、13.720 和 30.907，P值分别为0.038，0.010 和0.001），而未处理组和阴性对照组之间差异均无统计学意义（t值分别为0.614、0.049和0.755，P值分别为0.572、0.963和0.492）。见图1。

3.miR-373 表达下调对A431 细胞周期的影响：流式细胞仪检测结果表明，miR-373抑制剂组G0/G1期比例显著高于未处理组和阴性对照组，且差异均有统计学意义（t值分别为15.51、13.24，P值分别为0.000 1、0.000 2）S期比例显著低于未处理组和阴性对照组，且差异有统计学意义（t值分别为18.39、15.76，均P＜ 0.000 1）；G2/M期比例显著低于未处理组和阴性对照组，差异亦有统计学意义（t值分别为6.216、5.141，P值分别为0.003 4、0.006 8）。未处理组和阴性对照组之间G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例差异均无统计学意义（t值分别为1.822、0.821、2.169，P值分别为0.143、0.458、0.096）。见图2。

4.miR-373表达下调诱导A431细胞凋亡：miR-373抑制剂组中A431细胞早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡的细胞比例均显著高于另外两组（图3），且3组间差异均具有统计学意义（F值分别为279.369、19.775和135.739，均P＜ 0.01）。未处理组和阴性对照组之间早期凋亡、晚期凋亡及总凋亡细胞比例差异均无统计学意义（t值分别为0.165、0.354 和0.042，P值分别为0.877、0.741和0.968）。

图1 miR-373 表达下调对A431 细胞增殖的影响 a：与未处理组和阴性对照组相比，P ＜0.05

图2 各组A431细胞周期分布比较 a：与未处理组和阴性对照组相比，均P ＜0.01

图3 不同处理组A431 细胞早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡细胞比例比较 a：与未处理组和阴性对照组相比，均P ＜0.01

5.miR-373 表达下调对A431 细胞caspase-3 活性的影响：miR-373 抑制剂组caspase-3 活性为（1.238 ± 0.057），显著高于未处理组（0.413 ± 0.028）和阴性对照组（0.437 ±0.036），且差异有统计学意义（F=123.392，P＜ 0.05；t值分别为12.87、11.84，P值分别为0.000 2、0.000 3），而未处理组和阴性对照组间差异无统计学意义（t=0.519，P=0.631）。

三、讨论

研究表明，miRNA 介导的转录调控涉及肿瘤调控中的每一个环节，异常miRNA 表达与肿瘤细胞生物学过程密切相关，如凋亡逃避、增殖、转移和化疗抗性［8-9］。在这个过程中，一些miRNA 发挥癌基因的功能，而另一些扮演抑癌基因的作用［10］。类似地，miR-373在不同肿瘤中的作用也不尽相同，如在食管鳞癌［3］、宫颈癌［4］和胃癌［11］等肿瘤中发挥癌基因的功能，而在胆管癌［12］、结肠癌［13］和胰腺癌［14］等肿瘤中发挥抑癌基因功能，这可能与其靶向作用的基因不同相关。然而，迄今为止，miR-373在皮肤鳞癌中的功能尚不清楚，为了探讨其作用，我们在前期研究中检测人永生化上皮细胞（HaCaT细胞）和皮肤鳞癌细胞株中miR-373的表达，发现皮肤鳞癌细胞株中miR-373的表达水平均显著高于HaCaT细胞［7］，提示miR-373 可能在皮肤鳞癌中发挥癌基因的功能，因而其可能成为皮肤鳞癌潜在的分子治疗靶点。

Tanaka等［13］研究发现，miR-373的表观沉默在结肠癌细胞增殖中发挥抗增殖作用，这种作用可能与调控癌基因RAB22A的表达相关。此外，miR-373的过表达增加胃癌细胞的增殖潜能，这可能与肿瘤坏死因子α诱导蛋白1的表达水平下调密切相关，肿瘤坏死因子α诱导蛋白1的过表达可减弱miR-373抑制剂对胃癌细胞的抑制能力［11］。上述研究表明，miR-373在调控肿瘤增殖中具有重要的价值。本研究中我们也发现，miR-373 表达下调可显著抑制皮肤鳞癌A431 细胞的增殖，并且提高A431 细胞在G0/G1 期的比例，但降低S 期和G2/M 期细胞比例，提示miR-373 可能在皮肤鳞癌增殖调控中发挥重要作用。未来尚需通过实验进一步证实miR-373 调控的靶基因在皮肤鳞癌增殖中的作用，从而为miR-373的临床转化奠定基础。

miRNA 与肿瘤细胞凋亡密切相关，有些被鉴定为促凋亡miRNA［15］，而有些发挥抑制凋亡的作用［16］。为了进一步阐明miR-373 与皮肤鳞癌细胞凋亡的关系，我们采用流式细胞仪分析不同处理组之间细胞凋亡的变化。结果显示，抑制miR-373表达显著诱导细胞凋亡，提示miR-373在皮肤鳞癌中属于抗凋亡的miRNA分子。进一步研究表明，miR-373表达下调与caspase-3 活性升高密切相关，这可能是miR-373引发皮肤鳞癌细胞凋亡的可能分子机制。

总之，本研究结果表明，miR-373 表达下调可显著抑制皮肤鳞癌细胞的增殖，改变细胞周期分布和诱导细胞凋亡，其凋亡诱导作用可能与caspase-3活性升高有关。这些研究初步提示，miR-373可能在调控皮肤鳞癌细胞增殖、周期和凋亡中发挥关键作用，未来miR-373 可能成为皮肤鳞癌潜在的分子治疗靶点。本研究尽管提示miR-373在皮肤鳞癌中的初步作用，但尚需进一步阐明miR-373 在皮肤鳞癌中的靶点，从机制上阐明其在皮肤鳞癌发生发展中的作用，为以miR-373为靶点的治疗奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突