Sestrin2在慢性肾功能不全小鼠动脉粥样硬化血栓形成中的作用和机制

靳文 鄢文 李冬义 劳钰 刘一炫 陈洁琼 赵雅红

广东省第二人民医院1心血管内三科，2肿瘤一科（广州 510317）

动脉粥样硬化血栓性疾病具有高发病率、高致残和致死率等特征，是世界范围内人群死亡的首要原因，严重威胁人类的生命健康，已经成为当前迫切需要解决的重大公共卫生问题[1]。近年来已有多种有效药物和治疗手段应用于动脉粥样硬化血栓性疾病的防治，但是仍未能有效降低血栓性疾病的快速增长趋势和危害。积极探索动脉粥样硬化血栓性疾病的发病机制，是提高血栓性疾病防治水平的关键。慢性肾脏病是动脉粥样硬化血栓性疾病的重要危险因素，与动脉粥样硬化血栓性疾病的不良预后密切相关，其发病机制仍未完全阐明。

Sestrins是近年发现的一种进化上高度保守的的细胞应激诱导蛋白，属于Sestrins家族蛋白，其编码基因位于6号染色体q臂21位点[2-3]。Sestrin2是Sestrins家族重要成员之一，具有抗氧化应激和缺血再灌注损伤等作用[2-3]。多项研究结果提示Sestrin2可能具有直接或间接调控血栓形成作用[4-5]。为进一步明确Sestrin2在慢性肾功能不全促动脉粥样硬化血栓形成中的作用，本研究利用自发性动脉粥样硬化载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠，予以5/6肾大部分切除术制备慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠模型，分析Sestrin2在血小板活化、血栓形成中的作用。本研究将有助于进一步阐明动脉粥样硬化血栓形成的分子机制。

1 材料与方法

1.1 慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠模型制备选择30周龄高脂饮食饲养的SPF级雄性ApoE基因敲除小鼠[购买自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001]为研究对象，部分予以行5/6肾大部分切除术制备慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠模型，部分予以行假手术。小鼠5/6肾大部分切除术的简要操作如下：麻醉小鼠，待小鼠进入麻醉状态后，仰卧位固定小鼠，气管插管并应用小动物呼吸机辅助呼吸；沿小鼠腹中线作切口，依次剪开皮肤、筋膜、肌肉、腹膜，撕开左肾包膜，暴露左肾动脉及其分支血管。结扎两支前侧分支血管中的一支及背侧分支血管，以观察到肾脏明显变白为准。术后逐层缝合。予以碘伏消毒皮肤切口。2周后以相同手术操作方式行右肾全切除，4周后成模。假手术小鼠操作程序除不结扎左肾动脉分支和不切除右肾外，余操作程序同小鼠5/6肾大部分切除术。

1.2 实验分组实验共计分为3组，分别为对照组（8只）、慢性肾功能不全组（8只）和Sestrin2激动剂组（8只）。对照组予以行假手术，慢性肾功能不全组予以行5/6肾大部分切除术，Sestrin2激动剂组是在模型组基础上予以10 mg/kg Eupatilin灌胃1周，对照组和慢性肾功能不全组则予以等容量生理盐水灌胃1周。1周后各组小鼠用于后续各项实验研究。

1.3 检测FeCl3诱导的颈动脉血栓形成时间采用FeCl3诱导小鼠颈动脉血栓形成测定血栓形成时间，简要操作如下：小鼠经麻醉后无菌手术分离左侧颈动脉，经压力换能器与生物换能采集处理系统相连，连续检测颈动脉压力；放入0.2 cm宽的封口胶条备用。在分离备用的颈动脉环抱10%FeCl3溶液浸泡的滤纸条。通过观察颈动脉环抱的滤纸条的远心端颈动脉压力变化以反映血栓形成情况，连续监测90 min。动态观察并记录颈动脉压力变化。从开始给予颈动脉环抱滤纸条至颈动脉压力降至最低所需的时间即为血栓形成时间。

1.4 检测小鼠断尾出血时间小鼠经麻醉后，仰位放置于加热板上，设定温度为37℃，使其体温保持恒定；在小鼠尾端2 mm处，用手术剪断尾，并将鼠尾浸没于装有10 mL 37℃恒温的生理盐水，以断尾开始至鼠尾出血停止约1 min为出血时间。

1.5 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法染色检测小鼠颈动脉血栓形成小鼠处死后分离左侧颈动脉，予以脱水，固定，石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察血栓形成以及形态变化。

1.6 小鼠血浆和血小板的分离和制备将麻醉后的小鼠固定于手术台上，沿胸骨左缘切开胸腔，暴露心脏，使用1 mL注射器针头套上2 mL注射器针管进行心尖取血，针管中预先加入100 μL 3.8%的枸橼酸钠抗凝剂。采血后拔去针头，将血缓慢注入塑料离心管中；将血混匀后，室温100×g离心10 min；吸取上层富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）至另一个新的塑料离心管中，加入 0.1 μg/mL PGE1，37℃孵育20 min；室温400g离心10 min；离心后提取血浆用于后续实验研究，沉淀物以含0.02 U/mL三磷酸腺苷双磷酸酶的Tyrode′s buffer重悬，制备成洗涤血小板悬液，调整血小板终浓度至109个/mL。

1.7 流式细胞技术检测血小板内ROS和P-selectin的表达的表达分别将荧光探针DCFH-DA（1∶1000）、抗体CD62p-FITC孵育血小板，37℃，30 min，流式上机检测平均荧光强度（meanfluorescenceindex，MFI）。实验重复3次以上。

1.8 蛋白印迹法（Western blot）检测血小板Sestrin2的表达采用Western blot法检测Sestrin2蛋白水平表达。具体操作：首先提取血小板蛋白，将收集的血小板加入放射免疫沉淀分析裂解液，冰上孵育30 min，4℃12 000g离心30 min，将上清移至新的EP管中。接着，对提取蛋白进行定量，上样，电泳，转膜，封闭后加入一抗4℃孵育过夜，1×TBS液洗涤3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗涤3次。最后，化学发光试剂盒显色，暗室曝光，分析读取条带灰度值。

1.9 检测血浆肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的表达分别采用苦味酸速率比色法检测血浆SCr、脲酶波氏比色法检测血BUN的表达。具体操作参考试剂盒说明书。

1.10 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件进行分析，实验数据以表示，多组间样本的比较采用One-way ANOVA统计分析方法，组间的多重比较采用LSD检验；方差不齐时采用Welch法，组间多重比较则采用Dunnett′s T3。P＜0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sestrin2激动剂促进慢性肾功能不全小鼠血小板高表达Sestrin2WB检测结果显示：慢性肾功能不全小鼠血小板Sestrin2表达较对照组慢性降低（P＜0.05），Sestrin2激动剂上调慢性肾功能不全小鼠血小板Sestrin2的表达（P＜0.05）。见图1A。

2.2 Sestrin2激动剂抑制慢性肾功能不全小鼠颈动脉血栓形成FeCl3诱导的颈动脉血栓形成时间检测结果显示：慢性肾功能不全小鼠的颈动脉血栓形成时间较对照组明显减少（P＜0.05），Sestrin2激动剂能够显著延长慢性肾功能不全小鼠的颈动脉血栓形成时间（P＜0.05）。见图1B、C。

2.3 Sestrin2激动剂不增加慢性肾功能不全小鼠出血风险鼠尾出血时间检测结果显示：慢性肾功能不全小鼠的鼠尾出血时间较对照组无显著延长（P＞0.05），Sestrin2激动剂不增加慢性肾功能不全小鼠鼠尾出血时间（P＞0.05）。见图1D。

图1 Sestrin2对慢性肾功能不全小鼠颈动脉血栓形成时间、断尾出血时间的影响Fig.1 Effects of Sestrin 2 on carotid artery thrombosis time and tail-cutting bleeding time in mice with chronic renal insufficiency

2.4 Sestrin2激动剂抑制慢性肾功能不全小鼠血小板ROS生成和P-selectin表达流式细胞技术检测结果显示：慢性肾功能不全小鼠的血小板ROS生成和P-selectin表达较对照组明显增加（P＜0.05），Sestrin2激动剂能够显著减少慢性肾功能不全小鼠的血小板ROS生成和P-selectin表达（P＜0.05）。见图2。

2.5 Sestrin2激动剂改善慢性肾功能不全小鼠肾功能比色法检测结果显示：慢性肾功能不全小鼠的血浆BUN和Cr较对照组显著升高（P＜0.05），Sestrin2激动剂能够降低慢性肾功能不全小鼠的血浆BUN和Cr水平（P＜0.05）。见图3。

图2 Sestrin2对慢性肾功能不全小鼠血小板活性氧生成、P-selectin的影响Fig.2 Effects of Sestrin2 on platelet reactive oxygen species production and P-selectin in mice with chronic renal insufficiency

图3 Sestrin2对慢性肾功能不全小鼠血浆BUN和血Cr的影响Fig.3 Effects of Sestrin 2 on plasma urea nitrogen and creatinine in mice with chronic renal insufficiency

3 讨论

动脉粥样硬化血栓性疾病的发生、发展主要是由血管内皮损伤、血小板活性增强、凝血活性增强、抗凝活性减低等引起。其中，血小板的黏附、活化和聚集是维持血栓形成和出血之间平衡的重要环节[6-7]。血小板是血栓形成的主要介质，抗血小板药物是防治动脉粥样硬化血栓性疾病的“基石”。目前临床常用的抗血小板药物如阿司匹林、氯吡格雷、替格瑞洛等不同程度的降低了血栓性疾病的死亡风险，改善了血栓性疾病的预后。由于血栓性疾病病变程度和抗血小板药物的疗效和个体化反应不同，依然存在“阿司匹林抵抗”和“氯吡格雷抵抗”等现象[8-9]，以及发生出血等不良事件。理想的抗血小板药物应当具有高效的抗血栓形成能力和低出血风险，并具有心血管系统保护作用。因此寻找新的靶点，提高抗血栓能力，减少出血风险，降低心血管不良事件，是目前抗血小板药物研究的热点和难点。

哺乳动物Sestrins含有3个亚型，分别是Sestrin1、Sestrin2、Sestrin3，均具有抗氧化应激的作用。其中，Sestrin2的抗氧化能力最强，研究最为广泛。Sestrin2与血栓相关性疾病联系密切。原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）是经典ph（philadelphia）染色体阴性的骨髓增殖性肿瘤中最常见的亚型。血栓栓塞是ET最常见的并发症。利用单细胞测序技术检测JAK2阴性ET患者的全方位遗传信息显示SESN2（Sestrin2编码基因）、ST3、NTRK1、ABCB5、FRG1、ASNS、FRG1、ASNS、TOP1MT、DNAJC17等 8种基因突变与ET紧密相关，其中以SESN2基因突变与ET最为密切[4]；提示Sestrin2参与ET的血栓形成。为明确Sestrin2在慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化血栓形成中的作用，本研究发现FeCl3诱导的慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠颈动脉血栓形成能力显著增强，血小板Sestrin2的表达降低；予以Sestrin2激动剂Eupatilin干预后能够抑制慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠血栓形成，激活血小板Sestrin2表达；为明确Sestrin2参与血栓形成是否与凝血功能有关，本研究进一步研究发现慢性肾功能不全以及Sestrin2激动剂Eupatilin干预后小鼠鼠尾出血时间无显著变化。以上研究结果提示Sestrin2主要通过调控血小板聚集功能参与慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠血栓形成。

Sestrin2的晶体结构主要为伪对称的两个球形结构域：N末端结构域通过其螺旋-转-螺旋氧化还原酶降低活性氧产生，C末端结构域主要发挥抑制mTORC1的作用。以上从Sestrin2晶体结构揭示了其降低ROS的积累以及抑制mTORC1的机制。除此之外，Sestrin2还可通过作用于5′单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）激活作为Rheb的GTPase活化蛋白的抑癌基因结节硬化症蛋白2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2），使Rheb（一种Ras相关的GTP结合蛋白）携带GDP而抑制mTORC1活性，作为亮氨酸感受器调控营养敏感性Rag鸟苷三磷酸酶（Guanosine triphosphatases，GTPases）抑制 mTORC1 活性[2-3，10-13]。ROS和mTORC1是调控血小板活化和血栓形成的重要分子[5]，Sestrin2通过作用于mTORC1、ROS等对急性心肌梗死和脑缺血梗死发挥保护作用[14-17]。本研究发现慢性肾功能不全和动脉粥样硬化小鼠血小板ROS生成和P-selectin表达增加，Sestrin2激动剂能够抑制慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠血小板ROS生成和P-selectin的表达，提示Sestrin2可能通过抑制ROS产生发挥抗血小板活化以及血栓形成。

已有研究认为Sestrin2可减少肾脏氧化应激、降低血压、减少ROS产生[18]，本研究发现Sestrin2激动剂Eupatilin能够降低慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化小鼠血浆尿素氮和血肌酐，提示Sestrin2可能参与慢性肾功能不全的病理生理过程。针对Sestrin2如何改善肾功能以及是否通过改善肾功能间接抑制血小板活化有待于进一步研究。

综上，本研究首次发现Sestrin2参与调控慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化性血栓的形成，Sestrin2可能是防控动脉粥样硬化性血栓的潜在作用靶点。本研究未能探讨Sestrin2调控血小板活化及其在慢性肾功能不全合并动脉粥样硬化血栓形成中的具体机制。在今后研究中，将对此展开深入探讨。