PITX1 rs647161 位点基因多态性和环境交互作用与结直肠癌风险相关性研究

章 婷 徐 琦

最新数据显示，2011 年估计有310,244 例新诊断为结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的病例，占所有新诊断癌症病例的9.20%[1]。因此，结直肠癌正在成为民众生命健康的主要威胁。CRC 是一种由生活方式、营养、身体活动等环境因素和遗传因素等共同导致的疾病[2-4]。根据全基因组关联研究（GWAS），配对样同源域1（PITX1）遗传多态性已被新确定为特异于东亚人的CRC 敏感遗传因子[5]。目前，PITX1 基因多态性及其与环境的相互作用对CRC 发生风险的影响还缺少相关研究。PITX1 rs647161 位于5q31.1 区的5 号染色体上，其中一组单核苷酸多态性（SNPs）与CRC 发生有关[6]。在该区域的基因中，PITX1 最接近rs647161（上游约129kb）[7]。PITX1 在CRC 致癌过程中发挥重要作用，被认为是肿瘤抑制基因[8]。本研究采用病例对照研究的形式分析PITX1基因rs647161 位点单核苷酸多态性与CRC 易感性及其严重程度的相关性，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014 年5 月—2017 年12 月期间杭州市富阳区第二人民医院和浙江省肿瘤医院收治的CRC 患者120 例作为研究组，所有患者均接受结直肠癌根治术治疗，并能够取得组织进行病理诊断。TNM 分期：I 期22 例，II 期23 例，III 期35 例，IV 期40 例。根据研究组患者年龄、性别匹配在医院体检中心招募120 名健康体检者作为对照组。本研究经医院伦理委员会审核通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：（1）所有患者均经临床确诊后通过组织病理学证实为CRC[9]；（2）功能状态评分≥60 分[10]，（3）具有明显可测量的病灶。排除标准：（1）肝肾功能异常；（2）由两位经验丰富的副主任医师共同判定认为预计生存期＜6 个月；（3）对化疗药物不耐受。

表1 结直肠癌患者与健康体检者一般资料比较（

表1 结直肠癌患者与健康体检者一般资料比较（

注：BMI：身体质量指数；研究组：结直肠癌患者；对照组：健康体检者

组别研究组对照组t/χ2 值P 值例数120 120年龄（岁）57.54±10.11 58.43±12.32 0.61 0.54男性[n（%）]80（66.67）84（70.00）0.31 0.58 BMI（kg/m2）23.42±2.76 24.14±3.01 1.87 0.06吸烟[n（%）]34（28.33）32（26.67）0.08 0.77饮酒[n（%）]43（35.83）40（33.33）0.17 0.68家族史[n（%）]11（9.17）3（2.50）4.85 0.03

1.3 方 法 取受试者静脉血约3mL，使用血液基因组DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，货号DP318-02，批号2014051306）提取基因组DNA，使用primer premier 5.0 设计rs647161 位点PCR 扩增引物序列为上游：5’-GAAGGACCTGTGGTTGGTG A-3’；下游：5’-GGCTTGAAACCTCTACCTGGG-3’。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成后稀释成10pmol 的工作液。PCR 反应的体系为：DNA 模板50ng，2.5μL 10×buffer，1.5μL 25mM Mg2+，0.5μL 10mM dNTP，0.5μL 5U Taq 酶，10pmol 的上下游引物各0.5μL，用水补足25μL。PCR 后直接将PCR 产物寄送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，正反方向测序，结果见图1。

图1 PITX1 rs647161 位点各基因型测序结果

1.4 临床参数收集 收集所有受试者的年龄、性别、身体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟状况、饮酒状况、CRC 家族史以及CRC 患者的TNM 分期。

1.5 统计学方法 本研究所有数据的统计学分析均采用SPSS20.0 软件，计数资料用频数[n（%）]表示，组间统计学分析采用χ2检验。计量资料的表示方法为均数±标准差s） ，组间统计学分析采用t 检验，基因型频率是否符合Hardy-Weinberg 平衡采用χ2检验。采用非条件Logistic 回归模型估计优势比（OR）和95%置信区间（CI）。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般资料比较 研究组和对照组年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），研究组患者有CRC 家族史的比例显著高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.85，P=0.03），见表1。

2.2 PITX1 rs647161 位点基因多态性与CRC 风险相关性 PITX1 rs647161 位点基因型频率符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。研究组和对照组PITX1 rs647161 位点基因型频率比较，差异有统计学意义（χ2=7.70，P=0.02）。以野生型为参考，两组杂合子（CA）基因频率比较，差异无统计学意义（OR=1.04，95%CI=0.56～1.93，P=0.91），纯合子（AA）是CRC 的危险因素（OR=2.78，95%CI=1.22～6.39，P=0.01）。研究组A 等位基因频率显著高于对照组（χ2=6.99，P=0.01），A 等位基因是CRC 的高风险因素（OR=1.69，95%CI=1.12～2.53，P=0.01），见表2。

表2 结直肠癌患者与健康体检者PITX1 rs647161 位点基因型和等位基因频率比较

2.3 PITX1 rs647161 位点基因多态性和环境因素交互作用与CRC 风险相关性 在男性携带A 等位基因患CRC 风险没有显著升高（OR=1.11，95%CI=0.58～2.16，P=0.73），女性携带A 等位基因患CRC 风险显著升高（OR=3.70，95%CI=1.13～12.57，P=0.01）。在年龄＜50 岁的A 等位基因携带者CRC 风险没有显著升高（OR=0.89，95%CI=0.41～1.91，P=0.74），而年龄≥50 岁的A 等位基因携带者CRC 风险显著升高（OR=2.61，95%CI=1.13～6.04，P=0.01）。BMI＜25kg/m2的A 等位基因携带者没有CRC 发生风险（OR=0.87，95%CI=0.45～1.68，P=0.66），而BMI≥25kg/m2的受试者携带A 等位基因时CRC 发生风险显著升高（OR=5.33，95%CI=1.58～18.83，P＜0.01）。吸烟的A 等位基因携带者具有较高的CRC 患病风险（OR=4.33，95%CI=1.09～18.60，P=0.02），而不吸烟的A 等位基因携带者患CRC 风险并未显著升高（OR=1.16，95%CI=0.61～2.20，P=0.64）。饮酒的A 等位基因携带者具有较高的CRC 患病风险（OR=4.49，95%CI=1.41～14.88，P＜0.01），而不饮酒的A 等位基因携带者患CRC 风险并未显著升高（OR=0.98，95%CI=0.50～1.94，P=0.96）。有CRC 家族史和没有CRC 家族史的A 等位基因携带者患CRC 的风险均没有显著升 高（OR=0.27，95%CI=0.02 ～3.06，P=0.20；OR=1.27，95%CI=0.73～2.22，P=0.37），见表3。

2.4 PITX1 rs647161 位点基因多态性与CRC 严重程度相关性 以野生型（CC）为参考，杂合子（CA）和纯合子（AA）的CRC 患者TNM 分期在III 期和IV 期的比例显著高于I 期和II 期（OR=3.42，95%CI=1.25～9.57，P=0.01；OR=7.39，95%CI=2.06～28.94，P＜0.01），见表4。

3 讨 论

CRC 是我国乃至世界上许多其它地区最常诊断的恶性肿瘤之一[11]。近年来分子生物学和癌症遗传学的创新提高了对散发性和遗传性CRC 发病机制的理解[12-14]。用于分析基因组的复杂分子技术的发展使得能够鉴定涉及CRC 发病机理的若干遗传改变。

PITX1 是一种与bicoid 相关的同源域因子，是一种已知的转录因子，在发育中的垂体前叶腺中表达[15]。研究显示，PITX1 基因是一个抑癌基因，与CRC 的发展关系密切[8]。在研究PITX1 基因遗传变异时发现rs647161 位点多态性是疾病发生的重要风险因素，目前其功能尚未明确，该位点也不存在与任何已知的转录或者调解序列中[8]。虽然rs647161 具有不明确的功能，但全基因组关联研究（GWAS） 显示，rs647161 位点SNP 与CRC 发生具有一定联系[16-17]。PITX1 和该家族的其他成员参与胚胎发育[18]。此外，这些基因控制成熟组织的分化和增殖，并可作为肿瘤抑制基因在致癌过程中起到因果作用[19]。本研究结果发现，研究组患者中有CRC 家族史的比例显著高于对照组，说明CRC 家族史是CRC 的危险因素，与聂泓宇等[20]研究结果一致。分析结果显示，研究组和对照组PITX1 rs647161 位点基因型频率之间的差异显著，AA 基因型患CRC 的风险相比CC 基因型提高2.78 倍，A 等位基因携带者患CRC 的风险比C 等位基因高1.69 倍。从本研究结果可以看出，rs647161 位点基因检测可能对于临床上CRC 的预防具有重要意义。CRC 是遗传因素与环境因素共同决定的结果，因此本研究同时还分析了rs647161 位点与环境因素相互作用的情况，结果显示在男性、年龄＜50 岁、BMI＜25kg/m2、不吸烟、不饮酒这几类人群中rs647161位点A 等位基因携带者患CRC 的风险并没有显著提高，相反在女性、年龄≥50 岁、BMI≥25kg/m2、吸烟、饮酒这几类人群中A 等位基因携带者患CRC 的风险显著高于C 等位基因携带者，提示rs647161 位点与年龄、性别、BMI、吸烟、饮酒等因素之间存在相互作用影响CRC 患病风险。与此同时，我们发现在有CRC 家族史和没有CRC 家族史受试者中A 等位基因携带者患CRC 的风险并没有显著差异，由此说明rs647161 位点与CRC 家族史之间并没有显著相互作用。然而，由于本研究样本量有限，该研究发现可能还需要进一步扩大样本量进行研究。

表3 不同临床参数组PITX1 rs647161 位点基因多态性与CRC 风险的相关性分析

表4 PITX1 rs647161 位点基因多态性与TNM 分期之间的相关性

另外，本研究还分析了rs647161 位点基因多态性与CRC 患者疾病进展情况，我们主要是通过分析rs647161 位点基因多态性与CRC 患者TNM 分期之间的相关性，结果显示杂合子（CA）相比野生型疾病进展为III/IV 的风险升高了3.42 倍，纯合子（AA）相比野生型疾病进展为III/IV 的风险升高了7.39 倍，由此说明rs647161 位点基因多态性与CRC 患者疾病进展显著相关。尽管目前这些研究结果的具体机制并不清楚，但是该研究发现对于我们更好的理解癌症的病因学和预测癌症风险并采取预防措施具有积极的意义。

综上所述，PITX1 rs647161 位点基因多态性与CRC 风险和疾病进展有关，A 等位基因和性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒等因素的交互作用增加患CRC的风险，为了更好的预测和预防CRC 的发生，可能需要进一步扩大样本量进行研究。