山桐子油对力竭运动大鼠心肌线粒体的保护作用

潘文文，吴立明，崔 洁

(1.齐齐哈尔大学体育学院,黑龙江 齐齐哈尔 161000； 2.河北对外经贸职业学院 体育部， 河北 秦皇岛 066311； 3.哈尔滨工业大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150086)

山桐子，别名水冬瓜、水东桐、椅桐等，属落叶乔木。山桐子主要分布在中国、日本、朝鲜等东亚国家，在我国主要分布在四川、陕西、云南、贵州等省份[1]。山桐子对于环境的适应性很强，具有耐寒、耐旱、耐高低温等特点[2]。山桐子的果肉占果实总质量的62.3%，种子占37.6%，山桐子的果实、种子、果肉都可以用作油料，但是其不同部位的含油率差距较大，果肉含油率为43.6%，种子含油率为22.4%～25.9%[3-4]。山桐子油的脂肪酸组成很丰富，不饱和脂肪酸含量达到82%以上，其中包括亚油酸66%以上、油酸6.6%以上，果肉油还含棕榈酸5.12%，具有很高的食用价值[5]。山桐子油还含有一些甾醇类物质β-谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇等，其中β-谷甾醇相对含量较高，山桐子油维生素E含量高达111.75 mg/g[6-7]。生育酚是一种重要的生物抗氧化剂和自由基清除剂，可以增强机体的抗氧化能力和免疫能力[8]。当前对于山桐子油的研究主要集中在栽培、繁育等方面，对于食用价值以及营养保健方面研究甚少。

目前，大强度体育训练导致运动员猝死的事件频频发生。研究表明，力竭运动可以造成心肌组织功能损伤形成氧化应激，导致细胞凋亡、Ca2+超载以及能量代谢障碍等[9]。线粒体是能量产生的主要场所，其主要作用是改变心肌能量代谢障碍，机体在力竭运动时会产生较多的自由基，自由基增多产生细胞毒性，导致心肌损伤[10]。本文通过建立力竭大鼠模型，研究山桐子油对力竭大鼠心肌线粒体的影响，以期为山桐子油的应用开发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

山桐子，采自福建省华安地区；正己烷，天津科密欧试剂有限公司；活性白土(食品级)，济南奥凯化工有限公司；氢氧化钾，天津科密欧试剂有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)试剂盒，上海哈灵生物科技有限公司；ATP试剂盒、Ca2+试剂盒，上海酶联生物科技有限公司。

50只健康SD雄性大鼠，平均体重(180±5)g，北京科宇动物养殖中心(SYXK(京)2012-0004)。

TGL-16M型高速离心机，常州市金坛高科仪器厂；XB120A-SCS型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SA101型动物实验跑台，江苏赛昂斯生物科技有限公司；QM-SXT-2型索氏提取器，琪摩(上海)电子科技有限公司；RE-501L型旋转蒸发仪，上海科升仪器有限公司；安捷伦6890N+5973气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山桐子油的制备

将山桐子洗净并晾干，称取适量，粉碎过40目筛，放入索氏提取器中，加入正己烷，加热回流2.5 h，减压蒸馏并回收溶剂，得到山桐子毛油。山桐子毛油经碱炼脱酸、白土脱色后得到山桐子油[11-12]。

1.2.2 山桐子油理化指标测定

酸价测定，参照GB/T 5510—2011；碘值测定，参照GB/T 5532—2008；皂化值测定，参照GB/T 5534—2008；甾醇、维生素E含量测定，参照文献[13] 。

1.2.3 山桐子油主要脂肪酸组成分析

山桐子油经甲酯化后进行气相色谱-质谱分析。

气相色谱条件：安捷伦DB-624毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)；升温程序为155℃保持5 min，5℃/min升至240℃，保持20 min；载气为高纯度氮气，流量为1.0 mL/min；柱前压90.6 kPa；进样量1 μL；分流比20∶1。

质谱条件：EI离子源，离子源温度200℃；电子能量70 eV；接口温度240℃；溶剂延时4 min；倍增器电压1.5 kV；扫描范围 40～500 u。

1.2.4 实验动物分组以及测试

将大鼠随机分成5组，分别为对照组，力竭运动组，低、中、高剂量山桐子油组，其中对照组不进行任何运动，力竭运动组进行跑步运动训练，低、中、高剂量山桐子油组进行跑步运动训练的同时，运动后2 h分别灌胃山桐子油50、100、150 mg/kg。实验持续6周，每周6 d，周日休息。

跑步运动训练方法：将除了对照组之外的其余4组SD大鼠放置在运动跑台上进行训练，第一周先进行适应性训练，每组大鼠进行0°、10 m/min、30 min的运动，第二周开始每组大鼠进行5°、20 m/min的运动，直至力竭，记录大鼠运动的力竭时间。判断力竭的标准为：使用毛刷刺激大鼠尾部，如果大鼠跟不上预设速度，臀部压在跑台上，大鼠的后肢跟随转动跑台的皮带后拖达到30 s[14]。

在训练周的最后一日，待力竭运动组，低、中、高剂量山桐子油组进行完力竭运动后，将以上4组和对照组的大鼠立即断头处死，取出心脏，并用生理盐水冲净，取心肌组织30 mg，在冰浴中将心肌组织剪成碎片，加生理盐水制备10%的匀浆，过滤并弃滤渣，滤液在3 300 r/min下离心10 min，弃上清液，沉淀即为心肌线粒体，用生理盐水制成线粒体混悬液，于4℃留存备用。

1.2.5 SOD、GSH-Px、CAT、MDA、ATP、Ca2+含量测定

根据相应试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 数据分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析，数据均用“均值±标准差”表示，采取组间对比，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 山桐子油理化指标及主要脂肪酸组成

经测定，山桐子油酸价(KOH)为 0.864 mg/g，皂化值(KOH)为207.996 mg/g，碘值(I)为124 g/100 g ，不皂化物中甾醇相对含量为25.14%，维生素E的相对含量为18.34%。

从山桐子油中检测出5种主要脂肪酸(见表1)，分别为亚油酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸和硬脂酸，其中亚油酸含量最高。

表1 山桐子油中主要脂肪酸组成

2.2 山桐子油对力竭运动大鼠心肌线粒体ATP合成能力以及Ca2+含量的影响(见表2)

由表2可见，力竭运动组与对照组相比，ATP合成能力明显降低(P<0.05)，低、中、高剂量山桐子油组ATP合成能力呈上升趋势，高剂量组的ATP合成能力与力竭运动组相比明显增加(P<0.05)。ATP作为直接供给心肌能量的重要高能磷酸化合物，主要在线粒体中合成，力竭运动后ATP含量明显降低，导致了一系列代谢的异常和紊乱。山桐子油可以提高心肌线粒体内ATP的合成能力，改善大鼠力竭运动之后引起的ATP含量降低。力竭运动组与对照组相比Ca2+含量极显著增加(P<0.01)，低、中、高剂量山桐子油组Ca2+含量呈下降趋势，其中高剂量山桐子油组的Ca2+含量与对照组相比不具有显著性差异(P>0.05)，低、中剂量山桐子油组的Ca2+含量与力竭运动组相比明显降低(P<0.05)，高剂量山桐子油组的Ca2+含量与力竭运动组相比极显著降低(P<0.01)。钙是心肌细胞中维持正常生理功能的重要指标，细胞钙代谢异常会引起机体各种功能障碍，Ca2+转运主要依靠线粒体进行，力竭运动后，大量自由基生成，导致渗透性转运通道打开，使Ca2+大量释放，使细胞浆中Ca2+含量升高，导致钙超载，山桐子油中含有生育酚类物质，是一种重要的抗氧化剂和自由基清除剂，可在机体内起稳态调节的作用[8]，同时当Ca2+内流超过正常时，生育酚类物质可以起到Ca2+拮抗剂的作用，表明机体在长时间的力竭运动中，Ca2+转运是运动性疲劳更为敏感的指标，山桐子油对细胞内的Ca2+起到稳态调节的作用。

表2 山桐子油对力竭运动大鼠心肌ATP合成能力 以及Ca2+含量的影响

注：各组与对照组相比，#表示有显著差异(P<0.05)，##表示有极显著差异(P<0.01)；与力竭运动组相比较，*表示有显著差异(P<0.05)，* *表示有极显著差异(P<0.01)。下同。

2.3 山桐子油对力竭运动大鼠心肌线粒体SOD、GSH-Px、CAT、MDA的影响(见表3)

表3 山桐子油对力竭运动大鼠心肌线粒体SOD、GSH-Px、CAT、MDA的影响 U/mg

由表3可见：力竭运动组与对照组相比SOD活性明显降低(P<0.05)，低、中、高剂量山桐子油组SOD活性呈上升趋势，高剂量山桐子油组的SOD活性与力竭运动组相比明显增加(P<0.05)；力竭运动组与对照组相比GSH-Px活性极显著降低(P<0.01)，低、中、高剂量山桐子油组GSH-Px活性呈上升趋势，低、中剂量山桐子油组的GSH-Px活性与力竭运动组相比明显提高(P<0.05)，高剂量山桐子油组的GSH-Px活性与力竭运动组相比极显著提高(P<0.01)；力竭运动组与对照组相比CAT活性明显降低(P<0.05)，低、中、高剂量山桐子油组CAT活性呈上升趋势，高剂量山桐子油组的CAT活性与力竭运动组相比明显增加(P<0.05)。机体通过长时间的力竭运动之后可以导致心肌线粒体内抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)的活性明显下降，心肌线粒体内自由基增多，特别是过氧化物大量堆积，抗氧化酶被大量催化歧化反应而消耗，从而抑制SOD、GSH-Px、CAT的活性。SOD、GSH-Px、CAT具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质[15]。山桐子油具有较强的抗氧化能力，可以清除由力竭运动产生的大量自由基，进而提高SOD、GSH-Px、CAT的活性。

由表3还可以看出，力竭运动组与对照组相比MDA含量明显提高(P<0.05)，低、中、高剂量山桐子油组MDA含量呈下降趋势，高剂量山桐子油组与力竭运动组相比明显降低(P<0.05)。长时间力竭运动后MDA含量增加，MDA作为自由基与不饱和脂肪酸反应生成的代谢产物，可以反映机体的自由基代谢变化，作为机体内脂质过氧化反应的代谢产物，对细胞具有严重的损伤作用，心肌损伤导致ATP合成能力不足，无氧酵解增加，乳酸堆积，pH下降，细胞内酸中毒，致使线粒体肿胀[14]。山桐子油可以刺激抗氧化酶的活性，清除自由基，提高ATP合成能力，减少乳酸堆积，阻止pH降低，提高心肌收缩能力，从而降低MDA的含量，减少对细胞的损伤。

3 结 论

大鼠在经过力竭实验后，不同剂量的山桐子油对大鼠的心机线粒体影响不同，但均会增加ATP合成能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低Ca2+含量、MDA含量，并且以上指标呈量效关系。因此，山桐子油对力竭运动大鼠心肌线粒体的保护有很好的干预作用。