富油微藻的选育及规模化培养研究进展

黎秋玲，李 志，张庆华，刘孟荧，周智友，李汉广

(江西农业大学 生物科学与工程学院，江西农业微生物资源开发与利用工程实验室， 江西省菌物资源保护与利用重点实验室，南昌 330045)

传统生物柴油生产原料主要是各种天然动植物油脂、餐饮及食品工业的废弃油脂等。与这些生物质相比，微藻具有许多明显的优势[1-4]。微藻无需高质量的农业耕地，可利用污水、滩涂地、荒废地等非耕地进行生长，且生长速度快，脂肪含量高，部分微藻积累了大量可作为生物柴油主要原料的中性脂肪三酰甘油(TAG)，其单位面积油产量是油料植物的数十倍。但微藻在实验室和工业化培养中存在一定的差异，藻种的生命力(培养密度、育种、稳定性及特定环境中对掠食者的敏感性)随着环境的变化而变化，一方面规模化培养的微藻藻种仅有螺旋藻(Spirulinasp.)、小球藻(Chlorella)、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)和雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)等[5]，且这些藻种中能用于能源开发的微藻藻种更是少之又少；另一方面在已用于大规模培养的微藻中，油脂占藻体干重的比例仍然处于较低水平。虽然利用微藻生产生物柴油的技术难题已经被成功攻克，但就经济方面而言，从微藻原料中获得的生物柴油仍不能与传统化石燃料相抗衡[6]。在现阶段，微藻生物柴油与石化行业相比，并无明显经济优势。因此，要加快发展微藻生物能源技术，提高微藻的油脂含量、选择合适的规模化培养方式是目前微藻生物质能源必须解决的关键问题。本文系统介绍了近年来国内外微藻生物柴油的发展状况，对优良藻种的选育及常见的规模化培养系统进行阐述，并展望了微藻生物柴油未来发展趋势和潜在发展前景。

1 微藻生物柴油国内外发展状况

目前，全球正面临能源紧张的问题，解决能源危机能够直接影响全球经济的可持续发展。1978年起，美国能源部(DOE)实施了微藻等水生生物作为能源原料的计划[7]。20世纪90年代至21世纪初，日本国际贸易和工业部着手研究的微藻固定CO2能力和封闭式光生物反应器技术，是微藻固碳研究的开端[8]。2017年，日本研究集团Euglena和千代田公司签署了日本第一个以微藻为原料生产可再生喷气燃料和柴油燃料试验工厂的工程采购和建设合同，生产所得能源将在2019年用于航空和公共道路运输[9]。

微藻生物柴油的研究在我国发展较迟，从无到有，再到现在的小有所成，其中雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)的规模化生产突破了产业化中一系列限制性屏障。在产油微藻的研究方面，国内已有水生生物所、武汉植物园等单位开展了藻种的筛选、规模化培养等研究，并与大型石油化工企业进行合作，力求打开适合我国国情的微藻生物柴油产业化大门[10]。

2 优势藻种的筛选与获得

微藻的生物量和油脂含量是衡量能源微藻应用价值的两个重要标准。因此，筛选出优势藻种是实现微藻产业化生产生物柴油的关键因素之一。同时，也是从事微藻生物质能源基础研究的重要内容。

2.1 物理、化学诱变方法及基因工程筛选

油脂含量较高的微藻藻种主要分布在绿藻门(Chlorophyta)、硅藻门(Bacillariophyta)和金藻门(Chrysophyta)[11]。在农业系统中，微藻需要能够耐受温度、光照、盐度和病原体负荷等变化，才能使藻种在不同区域和季节被广泛培育。然而，在大规模农业或工业生产中使用的植物都不是野生型，野生型藻种不太可能具有农业或工业生产所需的所有特征[12]。为提高藻种的产油性能，对藻种进行物理、化学诱变以及基因改造是较为常用的手段。

大多数研究表明紫外线(UV)诱变[13]和化学诱变可以改善微藻的生物量或脂质含量。Liu等[14]对小球藻(Chlorella)进行UV诱变，与对照藻株相比，突变藻株的生物量提高了7.6%，脂质含量显示出不同程度的增加，最大值达到28.1%。Tanadul等[15]利用甲基磺酸乙酯(EMS)对小球藻(Chlorella)进行化学诱变，获得的诱变藻株脂质含量和脂质产率与野生型相比分别提高了59%和53%。Rismani-Yazdi等[16]重建特氏杜氏藻(D.tertiolecta)中生物燃料前体中与生产有关的代谢途径，在高盐浓度培养下，升高的盐浓度导致细胞总脂质含量增加22%。收获时微藻脂质含量接近于原始藻株的两倍，超过细胞干重的35%。Baek等[17]通过对莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)基因编辑，将藻种一步转化，改善了藻种的光合生产力。Zhu等[18]利用Hsp70A-RbcS2融合启动子，在叶酸中与叶绿体转运肽融合，使微藻的总脂肪酸含量比野生型增加22%，TAG含量增加32%。Ma等[19]通过在mRNA 水平上控制微拟球藻(Nannochloropsissalina)PDK基因(NsPDK)的表达使其体内的酶活性减弱，加快TAG的积累。

2.2 新型微藻筛选方法

为配合藻种的选育，提高筛选的效率和速度，选择新型微藻筛选方法，可快速筛选出目的藻种。Sung等[20]开发了一种微流体方法，通过简单操纵微流体装置中的磁场(91.90%的空白、87.12%的低密度和90.66%的高密度液滴可以分离成不同的出口)，用基于细胞密度的磁力微滴分离具有高生长性能的藻种。Kim等[21]通过使用微流体系统在单细胞水平上对趋光反应进行定量分析，由此将选择效率显著提高了8倍以上，并分别提高1.9倍的光自养细胞生长速率和8.1倍的脂质生产力。Hugo等[6]利用荧光激活细胞分选分离出一株有较大孔径、富含脂质的绿藻(Tetraselmissp. CTP4)。采用两阶段培养方式，其脂质含量占细胞干重的33%，脂质生产力达52.1 mg/(L·d)，并且CTP4的生物质能迅速脱水，可降低生物柴油精炼的下游加工成本，是一种非常有前景的优势藻种。

3 富油微藻的规模化培养

产油微藻工业化培养中，除了藻种本身油脂含量的重要性之外，能否进行高密度培养也具有重要意义。微藻根据自身不同属性及对光源和营养成分的需求，可分为光自养、异养、混养三种培养方式[22](见表1)。因此，可结合藻类生活习性和不同培养方式的特点，对光生物反应器进行改良和创新，研发出适合微藻规模化培养的新模式。

表1 不同培养方式的特点[22]

3.1 光自养方式

大多数微藻为光合自养型微生物[23]，其能够利用光作为能量来源把化学能转化为生物能。实验室条件下，利用人工光源的小规模培养难以满足微藻的产量需求，若想实现微藻的规模化培养，室外培养必不可少[24]。室外培养可分为开放式、封闭式和混合型光生物反应器。

3.1.1 开放式光生物反应器

开放式光生物反应器可以分为自然池塘、人工池、带搅拌装置的循环池以及人工制作的开放式光生物反应器。De Bhowmick等[25]在400 L的跑道池中养殖小球藻(Chlorellavariabilis)，测得微藻平均生长率为0.36 d-1，油脂含量(占藻体干重)10%。虽然油脂含量较实验室条件下培养偏低，但开放式跑道池构建单一、成本较低、便于操作，使其规模化培养的成本降低。为减少开放式光生物反应器易受环境等因素的干扰，可在开放式跑道池上方覆盖一些透光的物质，以解决夜间热损失、水汽蒸发、灰尘和昆虫等污染问题，使之成为封闭池[26]。

开放式跑道池对土地的利用率不高，为了提高土地的利用率，Hu等[27]利用开放式多层光生物反应器对微藻进行培养。藻液通过重力作用在每层反应器间流动，降低藻液流动能耗，同时利用空间延伸减少反应器的占地面积，实现了延长藻液流程及加快液体流速，能够有效获得微藻生物质，且所培养微藻的脂质含量达到(占干重)78%。为了克服层式光合反应器上层对下层的光源阻碍，唐伟伟等[28]设计开发了新型多层薄层贴壁光生物反应器装置，提高螺旋藻(Spirulinasp.)生物量，使其生物量产率最高达到45～60 g/(m2·d)，平均生物量产率达到30.3 g/(m2·d)。

3.1.2 封闭式光生物反应器

封闭式光生物反应器是针对开放式跑道池生物量产率低、易受外界污染和难控制培养条件等问题开发出的反应器结构，采取的方法主要是缩短光程(如薄腔室、细管)以及强化明暗交替[29]。封闭式光生物反应器与开放式光生物反应器比较具有以下优点：①不易受到污染，利于纯种的保护；②防止水分蒸发及培养液盐渍化；③冷却速度快，呼吸作用的损伤降低；④实现高密度培养；⑤浓度高，降低采收的成本；⑥温度等外界环境便于控制。

Pereira等[30]把绿藻(Tetraselmissp. CTP4)的培养扩大到100 m3的工业规模的管状光生物反应器(PBR)中，CO2平均减缓效率为65%，生物质与碳的比率为1.80，使CTP4具有良好的生物量生产力和光合能力。

在商业规模上，微藻的培育主要集中在封闭的管状光生物反应器上，但这些光生物反应器对土地有巨大的需求，并且构建和操作昂贵。然而，垂直柱式反应器如气升式光生物反应器，构造便宜、操作简单、结构紧凑，是微藻培养更加现实的选择。Sarat Chandra等[31]在3.4 L气升式光生物反应器中培养淡水绿藻(Scenedesmusobtusus)，生物质生产率最大达到0.07 g/(L·d)，在较高光照强度下或连续光补充培养的S.obtusus能产生理想的生物柴油来源。

3.1.3 混合型光生物反应器

结合不同反应器的优势，可设计出混合型光生物反应器耦合系统，使其满足规模化培养微藻的需求。应降果[32]设计的列管柱式光生物反应器与跑道池耦合系统，受光性能良好并能快速释放封闭式反应器中积累的热量至跑道池，同时加强了跑道池中的CO2吸收效率。利用该耦合系统培养微藻，可使微藻生物量、面积得率及体积产率比对照跑道池提高49%。Lee等[33]构建了α型管状混合型光生物反应器，可使光合有效辐射度和培养温度更加均匀，其微藻生物量密度超过10 g/L，日产量达72 g/(m2·d)。Huang等[34]在反应器内部使用特殊混合器促进沿着光照梯度的混合，促进藻液的混合。使藻液与营养因子等外界因素均匀接触。Ogbonna等[35]设计了一种新型内照明搅拌式光生物反应器，研究蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的规模培养，在反应器进行培养12 d后小球藻能获得藻质量浓度1.37 g/L，生长速率为0.164 kg/(m3·d)。Sung等[36]设计了一种新型的培养系统，把4个平板光生物反应器串联连接，通过一定的稀释速率向第一反应器中加入新鲜培养基，使该系统经受连续的恒化器培养，以提高海洋富油微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)的脂质生产力，其生物质产率可达20.0%以上，脂肪酸甲酯生产率达46.1%以上。

3.2 异养方式

微藻异养培养是指利用有机碳源维持藻类油脂积累及正常生长。微藻的异养分为3类：化能异养生长、光异养生长和光激活异养生长方式[37-38](见表2)。

表2 不同异养方式的特点[37-38]

3.2.1 化能异养

利用化能异养方式来实现规模化培养微藻主要有3种方式：分批、补料和连续培养。其中分批培养方式易于实施，但是随着培养液中能量的消耗，藻类的生长受到抑制或者停止，因而难以达到高的密度。因此，目前较为常见的培养模式为补料培养和连续培养。

Morales-Sánchez等[39]使用葡萄糖作为补充碳源，对富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)进行异养培养，培养期间保持C/N比为17∶1，脂质含量(占藻体干重)最高可达52%，脂质生产力达528.5 mg/(L·d)。谢明[40]利用异养—稀释—光诱导串联培养技术在500 L发酵罐中对蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)进行中试扩大培养，周期内藻细胞平均生长速率可达2.5 g/(L·h)，平均葡萄糖得率可达0.48 g/g，比生长速率可维持在0.025～0.03 h-1之间，可达到实验室培养水平。

3.2.2 光异养

光异养是指在光照条件下，向含碳源的培养液中加入DCMU培养微藻的方法。DCMU是光合作用抑制剂，可抑制非环式光合磷酸化，使其不再产生NADPH，从而导致微藻PS Ⅱ的活性受到抑制，影响微藻的正常代谢。牛海亚等[41]以DNP为解偶联剂，分别添加5×10-7、5×10-5mmol/L DNP，对小球藻(Chlorellasp. 484)进行光异养培养和混合培养，两种模式下FACHB 484生长状况未产生显著不同。Yang等[42]在2 L光生物反应器中光异养培养小球藻(ChlorellaminutissimaUTEX2341)，虽然研究中的脂质产量相对较低，生物量为13.1%，但生物质总产量(干重)较高，总脂质含量可达0.95 g/L。

3.2.3 光激活异养

在没有光合作用能量的情况下，专性光合自养生物不能生长和分裂，这是微藻代谢物的有效异养生成的主要障碍[43]。Anderson等[44]在对集胞藻(SynechocystisPCC 6803)进行5～10 min、40 μmol/(m2·s·d) 的光照培养，在完全黑暗中保持光激活异养生长，虽未对富油情况阐明，但此方式赋予富油微藻规模化培育新的可能。

3.3 混合培养

为结合自养培养和异养培养双方的优势，可采取混合培养，以光能和CO2等无机碳源为主，同时以有机碳源作为补充碳源。该培养方式中和了自养和异养两种方式的优缺点，是一种比较高效的培养方式。Roostaei等[45]对小球藻(Chlorellavulgaris)和二形栅藻(Scenedesmusdimorphus)进行混合培养，最大限度地利用资源，消除光限制。与自养条件相比，混合培养的微藻生物量高出2～3倍，脂质积累高出2～10倍，从而实现了更大的生物量和脂质含量。

4 结束语

目前，微藻生物质能源仍处于探索阶段，其中产油藻种的选育及其规模化培养是微藻生物能源的关键技术环节。这需要系统地研究不同诱变方式、培养方式以及光生物反应器等对微藻培育的影响。在产油藻种的选育及其规模化培养中，以下几个方面有待进一步研究：建立富油藻种的选育规程，通过物理、化学诱变及基因工程等手段，配合不同微藻筛选方法，提高筛选的效率和速度，以获得理想优势的藻种；研究微藻的规模化培养系统，通过对自养、异养及混养方式特点的了解，以及根据微藻本身性能的差异，采用高密度微藻的光生物反应器，从而开发出高效、低成本、易实施的微藻培养方式。

尽管来自藻类的生物能源生产仍然过于昂贵，且无法与化石能源竞争，但其仍是一种具有前瞻性和可持续性的生物质能源来源。若能把微藻规模化培育与环境保护、污水防治相结合，将会进一步降低其培养成本，必将有利于微藻生物能源的长远发展。