龙眼核活性脂质的分析及其细胞增殖活性研究

纪 漫，孙培冬

(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

活性脂质是甾醇、萜类、鞘磷脂、神经酰胺等具有生物活性的脂溶性物质。植物甾醇被科研工作者称为“Key to life”，具有降胆固醇、修复组织、抗炎等作用[1-2]。神经酰胺是近年来新兴的功能食品、药品和化妆品中的活性成分，具有保湿、屏障、抗衰老和抗过敏等作用[3-4]。由于神经酰胺在动植物中含量较少，寻求富含神经酰胺的生物材料已经成为神经酰胺开发与研究的热点。

龙眼(DimocarpuslonganLour.)俗名桂圆，是无患子科植物龙眼的果实，我国南方著名的药食两用水果[5]。在现代食品工业生产过程中，人们习惯留取龙眼肉而将龙眼核作为废料遗弃。中药理论认为[6]，龙眼核具有理气、化湿、止血等功效，用于治疗湿疮、疝气、创伤出血等。最近研究表明，龙眼核提取物中含有大量的生物活性物质，如多糖、类黄酮、植物甾醇和鞘磷脂等，具有降血糖、抗氧化、抗炎和抗衰老等活性[7-9]。人们对龙眼核中活性物质的研究主要集中在多糖和多酚等水溶性物质，对龙眼核中活性脂质的研究较少。

本文结合植物甾醇和神经酰胺相似的极性等物理性质，在前期分离纯化过程中，以植物甾醇含量为主要指标，监测神经酰胺的富集相，定性定量地检测神经酰胺类物质。采用CCK-8法研究龙眼核活性脂质对人皮肤成纤维细胞(HSF)和人永生化角质形成细胞(HaCaT)活性的影响，为龙眼核活性脂质作为功效性原料添加到日用化学品中提供了可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

龙眼核，原产地广西玉林，购于汇丰药材商行；豆甾醇(纯度>95%)，购自上海源叶生物科技有限公司；C16神经酰胺(C16-CER)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，购自Sigma公司；N-油酰基-植物鞘氨醇(商品级CER-3)，购自上海言臻贸易有限公司；HSF、HaCaT细胞，购自北纳创联生物科技有限公司；DMEM高糖培养基、pH 7.4磷酸盐缓冲(PBS)溶液、0.25%胰酶、青霉素-链霉素双抗、购自Thermo-Fisher公司；胎牛血清，购自Gibco公司；CCK-8试剂盒(500T)，购自碧云天生物技术研究所；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

RE-52AA旋转蒸发器，KH-100E型超声波清洗器，TU-1901紫外-可见光分光光度计，NICOLEY-6700型全反射傅里叶红外光谱仪，Ultimate 3000 RS型超高效液相层析仪，Wonda Cract ODS-2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，LyoQuest Plus-85型冷冻干燥机，Forma3111二氧化碳培养箱，Synergy H4多功能酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 超声提取龙眼核脂质粗提物

准确称取龙眼核粉120 g于2 000 mL锥形瓶中，以95%乙醇为提取溶剂，在料液比1∶ 15、提取温度60℃下超声辅助提取40 min。反应结束后，抽滤得滤液，用旋转蒸发仪旋蒸至恒重，冷冻干燥得龙眼核脂质粗提物(LNE)。按式(1)计算得率。

得率=粗提物质量/龙眼核粉质量×100%

(1)

1.2.2 分级萃取

准确称取10.0 g LNE加入20 mL水超声分散，置于分液漏斗中，依次用石油醚、正己烷、氯仿、正丁醇进行萃取，料液比为1∶ 10，萃取3次，合并相同溶剂萃取相，减压浓缩后冷冻干燥得石油醚相(PEP)、正己烷相(HEP)、氯仿相(CEP)、正丁醇相(BEP)。

1.2.3 柱层析分离

采用湿法装柱，将已经用石油醚浸泡超声30 min的100 g硅胶(200～300目)装入层析柱(26 mm×500 mm)中，准确称取1 g CEP干法上样后进行硅胶柱层析。洗脱剂梯度依次为体积比分别为9∶ 1、7∶ 3、5∶ 5、3∶ 7、1∶ 9的石油醚-乙酸乙酯，分别洗脱200 mL，顺序收集洗脱液，得到5个组分CEP-1～CEP-5。将各组分减压浓缩，冷冻干燥后测定得率和总甾醇含量。

1.2.4 总甾醇含量测定

采用Lieberman-Burchard法测定样品中总甾醇含量[10]。以CHCl3为溶剂，配制1.0 mg/mL豆甾醇标准溶液。分别精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL豆甾醇标准溶液，加入浓硫酸-乙酸酐(体积比1∶ 20)显色剂2.0 mL，用CHCl3定容至5 mL。摇匀、超声显色10 min，以CHCl3为参比溶液，在710 nm处测量吸光值，试验重复3次。以豆甾醇质量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线回归方程为y=1.367 1x+0.000 7，R2=0.999 7，在0.2～1.0 mg的范围内呈良好的线性关系。

配制一定质量浓度的样品，按上述方法测定样品的吸光值。样品中总甾醇含量按式(2)计算。

样品中总甾醇含量=样品中豆甾醇的质量×稀释倍数/样品质量

(2)

1.2.5 FT-IR分析

取少量冷冻干燥后的样品，使其将傅里叶红外光谱仪的激光探头完全覆盖，压紧旋钮，进行测试。仪器工作条件为：分辨率2 cm-1，样品平均扫描100次，扫描范围4 000～500 cm-1。

神经酰胺含量的测定参照HPLC-ELSD分析方法[11]。层析柱为Wonda Cract ODS-2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相A为超纯水，流动相B为甲醇，先线性洗脱20 min，从97%B到100%B，再等度洗脱10 min，洗脱剂为100%B，然后进行平衡过程，溶剂为97%B；流速0.8 mL/min；柱温30℃；进样量5 μL；蒸发光散射检测器漂移管温度65℃；气体流速1.5 mL/min。

配制质量浓度分别为0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5 mg/mL的系列C16-CER标准溶液，进样量均为5 μL，进行标准曲线的绘制。取C16-CER质量M的对数(lgM)为横坐标，峰面积S的对数(lgS)为纵坐标，绘制标准曲线。配制10.0 mg/mL的CEP-1、CEP-2、CEP-5溶液，进样量均为5 μL，进行HPLC-ELSD分析。

根据HPLC-ELSD分析结果，C16-CER和豆甾醇的保留时间分别为17.96 min和26.82 min。C16-CER标准曲线的线性回归方程为lgS=1.607 4 lgM+1.489 6，R2=0.996 9。相对标准偏差(RSD)为0.81%，在试验范围0.18～3 μg内呈良好线性关系。

1.2.7 龙眼核活性脂质成分鉴别

采用理化鉴别方法[12-13]，初步鉴别LNE、CEP、CEP-2中的有效成分，如：神经酰胺类、三萜类、生物碱类、皂苷类、鞣质及酚类、黄酮类和有机酸类物质。其中薄层色谱[14]以氯仿-甲醇(体积比19∶ 1)为展开剂，10%磷酸-硫酸铜为显色剂，120℃烤板10 min进行显色反应。

1.2.8 细胞培养及CCK-8测定

配制含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，将HSF和HaCaT细胞培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。待细胞生长到90%融合时，加入0.25%胰酶消化传代。

参照刘艳秋等[15]的方法，采用CCK-8法评估LNE、CEP、CEP-2的细胞毒性。取10～30代处于对数生长期的HSF和HaCaT细胞，分别以7.5×103、10×103个/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL(空白组除外)，培养24 h待细胞贴壁后，移去孔中培养液。以DMEM为溶剂，配制成不同质量浓度的样品溶液，每孔加入100 μL样品溶液处理24 h，以100 μL DMEM代替样品作为对照，每组设置3个复孔。移去孔中培养液，用PBS冲洗两遍，每孔加入100 μL 10% CCK-8溶液，并向不含细胞的孔中加入100 μL 10% CCK-8溶液作为空白，于培养箱中避光孵育1 h。孵育结束后，用酶标仪测定其在450 nm处的OD值。细胞存活率按式(3)计算。

她的堂妹妹，我见过，永久是穿着深色的衣裳，黑黑的脸，一天到晚陪着母亲坐在屋子里。母亲洗衣裳；她也洗衣裳，母亲哭，她也哭。也许她帮着母亲哭她死去的父亲，也许哭的是她们的家穷。那别人就不晓得了。

细胞存活率=(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%

(3)

2 结果与讨论

2.1 萃取相得率及总甾醇含量

采用超声辅助乙醇提取法从龙眼核粉中提取活性脂质，粗提物得率为10.86%，总甾醇含量为5.28 mg/g。

各萃取相的得率及总甾醇含量如表1所示。

表1 不同萃取相得率及总甾醇含量

由表1可知，氯仿相得率最大，为34.62%，但是植物甾醇主要富集在正己烷相和氯仿相，这两相的总甾醇含量分别为216.42 mg/g和191.95 mg/g。综合考虑各萃取相的得率和总甾醇含量，选择氯仿相进行硅胶柱层析分离。

2.2 硅胶柱层析分离各组分总甾醇含量

CEP经硅胶柱层析分离后得5个组分，各组分得率及总甾醇含量见表2。

表2 硅胶柱层析分离组分得率及总甾醇含量

由表2可知，甾醇主要集中在组分CEP-2中，含量为518.26 mg/g，其次甾醇含量较高的组分为CEP-1，甾醇含量最少的组分为CEP-5。因此对这3个组分进行HPLC-ELSD检测，以验证甾醇含量与神经酰胺含量之间的关系。

2.3 FT-IR分析

CEP-2的FT-IR分析结果如图1所示。

图1 CEP-2的FT-IR图谱

2.4 HPLC-ELSD分析

CEP-1、CEP-2和CEP-5的HPLC-ELSD图谱如图2所示。

由图2可知：CEP-1在豆甾醇保留时间27 min左右仅有一个较小的峰出现，但在神经酰胺的保留时间18 min左右并没有出现峰；CEP-5中未检出神经酰胺和甾醇类物质；CEP-2在27 min附近出现了一个平头峰，表明CEP-2中甾醇含量较高，同时在18 min左右出现了一个小峰，表明CEP-2中含神经酰胺类物质。由TLC分析结果可知，C16-CER和豆甾醇的比移值分别为0.482、0.727；将这3个物质进行TLC定性分析，CEP-1仅在比移值0.482处出现了颜色较浅的点，CEP-5在比移值0.482和0.727处均未出现点，CEP-2在比移值0.482和0.727处均出现了点。综合HPLC-ELSD和TLC分析结果可知，以上3种物质，CEP-2中植物甾醇含量最高，神经酰胺含量也最高。根据C16-CER标准曲线所得的线性方程，得CEP-2中神经酰胺的含量为2.65 mg/g。

图2 CEP-1、CEP-2、CEP-5的HPLC-ELSD图谱

2.5 龙眼核活性成分检识

为了进一步定性地验证龙眼核提取纯化各组分的活性成分，对LNE、CEP、CEP-2中的活性成分进行鉴别，结果如表3所示。

表3 龙眼核活性成分鉴别结果

注：检识结果中“+”表示有现象，“-”表示无明显现象。

由表3可知:LNE和CEP中所含的物质类似，含有三萜类、生物碱类、皂苷类、鞣质及酚类、黄酮类和有机酸类，但由于氯仿的极性比乙醇小，所以经过氯仿萃取后，除去了亲水性的生物碱类及苷类；CEP-2中含三萜类、神经酰胺类、鞣质及酚类物质。LNE和CEP通过TLC定性分析，未检测出神经酰胺类物质，而CEP-2中检测出神经酰胺类物质，说明龙眼核脂质粗提物中神经酰胺类物质的含量较低，通过硅胶柱层析，富集了活性脂质中的神经酰胺类物质。

2.6 CCK-8细胞增殖活性

为确保样品的安全性，采用CCK-8法测定不同质量浓度LNE、CEP、CEP-2及商品级CER-3对HSF和HaCaT细胞存活率的影响，结果分别见图3、图4。以仅含DMEM的培养基作为对照组，细胞的活力设定为100%。

图3和图4中*代表采用ANOVA-Tukey相关性分析计算出的p值(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

图3 不同样品处理的HSF细胞活力评估

由图3A可知，当样品的质量浓度为125 μg/mL时，LNE处理的HSF细胞的存活率为85.27%(p<0.01)，CEP处理的HSF细胞存活率为89.35%(p<0.01)。由图3B可知，CEP-2在试验范围20～100 μg/mL内，对HSF细胞均没有毒副作用，存活率均大于93%。说明随着样品中植物甾醇和神经酰胺的富集，相同质量浓度的样品处理的HSF细胞存活率增加。当CER-3质量浓度为40 μg/mL，HSF细胞的存活率为112.26%(p<0.01)，说明神经酰胺能促进HSF细胞增殖；40 μg/mL的CEP-2处理的HSF细胞的存活率为105.28%，推测原因是CEP-2中神经酰胺的种类和含量与CER-3不同，对HSF细胞的增殖作用不明显。

由图4A可知，LNE对HaCaT细胞无增殖活性，而CEP质量浓度为60 μg/mL时，对HaCaT细胞具有轻微的增殖作用，细胞存活率为105.09%。由图4B可知，CEP-2在试验范围20～200 μg/mL内，对HaCaT细胞均没有毒副作用，细胞存活率均大于95.29%，且当CEP-2质量浓度为100 μg/mL时，HaCaT细胞的存活率最大，为114.21%(p<0.001)。说明分离纯化后的活性脂质有助于HaCaT细胞的生长增殖。80 μg/mL的CER-3处理的HaCaT细胞，细胞存活率为116.67%；纯化后的活性脂质CEP-2与商品级CER-3对HaCaT细胞的增殖作用相当。

3 结 论

通过超声辅助乙醇提取法得到龙眼核脂质粗提物，经氯仿萃取和硅胶柱层析分离得到活性脂质CEP-2，其主要成分为三萜类、神经酰胺类、鞣质及酚类物质，总甾醇含量为518.26 mg/g，神经酰胺含量为2.65 mg/g。根据CCK-8细胞增殖试验可知，40 μg/mL CEP-2对HSF细胞具有轻微的增殖作用，细胞存活率为105.28%；100 μg/mL CEP-2对HaCaT细胞的增殖作用较明显，细胞存活率为114.21%(p<0.001)，且其与商品级CER-3对HaCaT细胞的增殖活性相当。本文定性定量地检测龙眼核中的神经酰胺，为龙眼核作为制备神经酰胺的原料提供了研究方向，也为神经酰胺的分离鉴定提供了一种简单、安全有效的方法；同时表明龙眼核活性脂质有望作为功效性成分添加于日用化学品中。