酶法合成中长碳链甘油三酯

徐文迪，缪智诚，王小三，金青哲，王兴国

(江南大学 食品学院，江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122)

中碳链脂肪酸是含有6～12个碳原子的脂肪酸，在人乳脂中的含量为7%～13%[1-3]。人乳脂中大部分的中碳链脂肪酸与长碳链脂肪酸结合形成中长碳链甘油三酯(MLCT)，约占人乳甘油三酯总量的20%[4-5]。MLCT消化吸收速度快[6-7]，能为婴儿快速提供能量，还能补充必需脂肪酸。此外，MLCT水解产生的中碳链脂肪酸及其单甘酯还具有较强的抑菌和抗病毒活性[8-9]。相关研究[10-11]表明，中碳链脂肪酸及其单甘酯能促进乳杆菌和双歧杆菌的生长，其特定的抗菌活性会影响婴儿早期肠道菌群的建立。

婴儿配方奶粉中通常以添加椰子油的形式补充中碳链脂肪酸，其所含的中碳链甘油三酯与人乳脂中的MLCT存在较大差异[4-5,12]。目前国内外虽已有大量合成MLCT的研究[13-15]，但是合成与人乳脂结构相似的MLCT的报道尚少。人乳脂中的中碳链脂肪酸以月桂酸为主[1-3]，而此前研究较多的是辛酸和癸酸。月桂酸的抗菌活性是中碳链脂肪酸中最强的[10]，与辛酸和癸酸相比更有利于增强婴儿对病原体的抵抗力。人乳脂中的MLCT可以分为单中碳链甘油三酯(LLM)和双中碳链甘油三酯(MML)，ECN(当量碳原子数)的分布范围为36～46，集中分布在38～44，其中含量较高的MLCT有OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OMLa、OPCa、LPCa、LLLa、OLaLa及LLaLa[4-5]。

本研究以富含中碳链脂肪酸的椰子油和实验室制备的富含OPO和OPL的油脂为原料，采用脂肪酶NS40086为催化剂，酶法合成和人乳甘油三酯结构相似的MLCT。由于ECN为36、46可能会混入未完全反应的中碳链甘油三酯和长碳链甘油三酯，因此本研究选择ECN 为38～44的MLCT的含量作为优化指标，确定酶法酯交换合成MLCT的最优条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

棕榈硬脂(熔点58℃)，益海嘉里有限公司；椰子油，东海粮油工业(张家港)有限公司；油酸(85%)，阿拉丁有限公司；脂肪酶NS40086，诺维信生物技术有限公司；猪胰脂酶，Sigma- Aldrich (中国)公司；亚油酸(65%)、无水乙醚、甲醇、正己烷、胆酸钠、氯化钙、无水硫酸钠、氢氧化钾、盐酸、乙酸，分析纯；乙腈、异丙醇、正己烷，色谱纯。

Agilent 7820A气相色谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；Alltech 3300蒸发光散射检测器，美国Grace公司；Waters 1525 高效液相色谱仪、2414型示差检测器、Waters Acquity UPLC、Waters Xevo G2-S Q-TOF质谱仪，沃特世科技有限公司；KDL2短程分子蒸馏设备，德国UIC公司；HH-601恒温水浴锅；RT 10磁力搅拌器。

1.2 实验方法

1.2.1 酶法合成富含OPO和OPL的结构脂

溶剂法分提棕榈硬脂：58℃棕榈硬脂按1∶ 5加入丙酮，于60℃下充分溶解，在38℃下结晶3 h，抽滤得到高熔点棕榈硬脂，旋蒸除去丙酮。

将分提后的棕榈硬脂与油酸、亚油酸按摩尔比1∶ 8∶ 4混合，加入底物总质量8%的脂肪酶NS40086，60℃下磁力搅拌反应4 h，反应结束后离心除去脂肪酶，加入1.5倍中和游离脂肪酸所需的0.5 mol/L KOH-乙醇溶液脱除游离脂肪酸[16]，得到富含OPO和OPL的结构脂。

1.2.2 酶法合成中长碳链甘油三酯

将制备得到的富含OPO和OPL的结构脂与椰子油(底物)按照一定的摩尔比混合，加入一定量的脂肪酶NS40086，在一定温度下磁力搅拌反应一段时间，反应结束后离心除去脂肪酶，得到富含MLCT的产物。

1.2.3 分子蒸馏纯化酯交换产物

分子蒸馏条件：蒸发面温度210℃，压力1 Pa，进料速率2.5 mL/min，刮板转速120 r/min，冷凝器温度30℃。

1.2.4 总脂肪酸组成分析

脂肪酸甲酯的制备： 40 mg油样加入2 mL正己烷，然后加入0.5 mL KOH-CH3OH溶液(2 mol/L)，振荡1 min，取上清液加入无水硫酸钠，过0.22 μm有机滤膜后进气相色谱仪分析。

气相色谱条件：Trace TR-FAME色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher Scientific)；氢火焰离子化检测器，检测器和进样口的温度均为250℃；升温程序为初始柱温100℃，保留1 min，以5℃/min的速率升温到220℃，保留15 min。

1.2.5 sn-2位脂肪酸组成分析

取100 mg样品加入2 mL Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)、0.5 mL 0.05%胆酸盐溶液、0.2 mL 2.2%CaCl2溶液及20 mg猪胰脂肪酶，旋涡振荡1 min。置于40℃水浴中反应6 min，每3 min取出振荡30 s。反应结束后加入1 mL 6 mol/L盐酸和2 mL乙醚，振荡，5 000 r/min离心3 min，取上清液氮吹至约300 μL。样品进行薄层色谱层析，展开剂为正己烷-乙醚-乙酸(体积比50∶ 50∶ 1)。刮取sn-2-单甘酯条带，用乙醚萃取并用氮气吹干。甲酯化处理方法和气相色谱分析条件同1.2.4。

1.2.6 甘油三酯组成分析

RP-HPLC-ELSD分析甘油三酯组成。样品溶于正己烷中，质量浓度20 mg/mL，进样量10 μL。色谱条件：Lichrospher C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm × 5 μm)，柱温30℃；流动相A为乙腈，流动相B为异丙醇，流速0.8 mL/min，梯度洗脱程序为0～40 min 60%A，45～85 min 55%A，90 min 60%A；雾化室温度55℃；气体流速1.8 L/min；增益1。

NP-HPLC分析甘油酯、游离脂肪酸含量。采用配备有Sepax HP-Silica硅胶柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)和示差检测器的液相色谱仪分析。样品溶于正己烷中，质量浓度20 mg/mL，进样量20 μL。色谱条件：柱温35℃；流动相为正己烷-异丙醇-甲酸(体积比15∶ 1∶ 0.03)，流速1 mL/min。

UPLC-Q-TOF-MS鉴定甘油三酯构型。采用配备BEH C18柱(2.1mm×50 mm, 1.9 μm)和四级杆飞行时间质谱仪的超高效液相色谱系统分析。色谱及质谱条件参考Zhang等[17]的方法。结果中表示的甘油三酯构型未区分位置异构体。

2 结果与讨论

2.1 反应底物的甘油三酯组成

椰子油和实验室制备的富含OPO和OPL的结构脂的甘油三酯组成如表1、表2所示。

表1 椰子油的甘油三酯组成 %

注：Cy. C8∶ 0; Ca. C10∶ 0; La. C12∶ 0; M. C14∶ 0; P. C16∶ 0; S. C18∶ 0; O. C18∶ 1; L. C18∶ 2。下同。

表2 富含OPO和OPL结构脂的甘油三酯组成 %

由表1、表2可知，椰子油的甘油三酯中含有较多的LaLaLa、LaLaCa、LaLaM等，而富含OPO和OPL的结构脂的主要甘油三酯类型为OPO、OPL、PPO和PPL。采用sn-1,3位特异性的脂肪酶催化两种油脂的酯交换反应，可得到与人乳脂结构类似的MLCT，如OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OMLa、OPCa、LPCa、LLLa、OLaLa及LLaLa等。

2.2 反应体系的确定

酯交换反应分别在无溶剂体系和溶剂体系中进行，探究反应体系对产物中MLCT含量的影响。无溶剂体系：将富含OPO和OPL的结构脂与椰子油按照底物摩尔比1∶ 1混合，加入底物总质量8%的脂肪酶，在60℃下进行反应。溶剂体系：加入3 mL正己烷，其他条件与无溶剂体系相同。产物经RP-HPLC-ELSD分析，结果如图1所示。

图1 反应体系对产物中MLCT含量的影响

由图1可以看出，溶剂体系与无溶剂体系相比，初始反应速率快，在2～4 h内MLCT含量高于无溶剂体系。这是由于溶剂体系中加入了正己烷，降低了体系的黏度，增加了反应底物之间的传质和热传递，有利于酯交换反应的进行。但是在反应达到平衡时，两者的MLCT含量没有显著性差异，并且无溶剂体系在相同的反应容器中有更高的反应体积，同时省去除去正己烷的步骤，可以节约成本，提高生产效率，有利于工业化生产。综合考虑，选择无溶剂体系进行后续反应。

2.3 底物摩尔比的影响

将富含OPO和OPL的结构脂与椰子油(底物)以不同的摩尔比混合，加入底物总质量8%的脂肪酶，在60℃下进行酶催化反应，探究底物摩尔比对产物中MLCT含量的影响。产物经RP-HPLC-ELSD分析，结果如图2所示。

图2 底物摩尔比对产物中MLCT含量的影响

由图2可以看出，当底物摩尔比为1.5∶ 1时，MLCT含量在反应过程中始终低于其他4组。这是由于底物中的长碳链甘油三酯的含量偏多，没有足够的中碳链甘油三酯与之反应，导致产物中的MLCT含量偏低。与之类似，反应底物中的中碳链甘油三酯含量过剩，也会导致产物中MLCT的含量偏低。当底物摩尔比为0.8∶ 1时，产物中MLCT含量最高。因此，选择底物摩尔比0.8∶ 1进行后续反应。

2.4 反应温度的影响

反应温度是影响酯交换反应的重要因素，温度会影响酶的催化活性及稳定性，还会影响反应体系的传质[18]，尤其是在无溶剂体系中。本研究在底物摩尔比0.8∶ 1，加入底物总质量8%的脂肪酶，反应温度50～70℃下进行反应，探究反应温度对产物中MLCT含量的影响。产物经RP-HPLC-ELSD分析，结果如图3所示。

图3 反应温度对产物中MLCT含量的影响

由图3可以看出，MLCT含量随着反应温度的升高而增加。反应在6 h时趋于平衡，此时65℃条件下的产物中MLCT含量达到了70.44%，高于50、55℃及60℃反应条件下MLCT含量。这是由于较高的温度有利于降低反应体系的黏度，增加底物间的相互作用，加快酯交换反应进程[19]，从而提高产物中MLCT含量。当反应温度从65℃继续升高到70℃时，在反应初期，70℃条件下产物中MLCT的含量较高，但在反应达到平衡时，两者没有出现显著性差异。虽然高温能够增加反应的初始速率，但会影响酶的稳定性和使用寿命，同时也会增加能耗。综合考虑，选择65℃作为最佳反应温度进行后续反应。

2.5 加酶量的影响

在底物摩尔比0.8∶ 1条件下，加入不同量的脂肪酶，于65℃下进行酯交换反应，探究加酶量对产物中MLCT含量的影响。产物经RP-HPLC-ELSD分析，结果如图4所示。

图4 加酶量对产物中MLCT含量的影响

由图4可知，当加酶量在4%～8%的范围内时，产物中的MLCT含量随着加酶量的增加而增多。加酶量为8%～12%比加酶量4%和6%先达到反应平衡，这是由于当加酶量较低时，没有足够的酶与底物接触，导致反应速度慢，反应达到平衡的时间长；随着加酶量的增多，酶与底物的接触频率增加，从而加速酯交换反应[20]。加酶量还会影响反应体系的传质阻力，当其对传质阻力的影响大于对反应速率的影响时，继续增加加酶量对反应的影响不大，这与加酶量从8%增加到12%时MLCT含量没有出现显著性差异这一结果相符。为了提高产物中MLCT含量，同时考虑到成本因素，最终选择8%作为最优的加酶量。此时，反应在6 h时已达到平衡。最优条件下，产物中的MLCT含量为70.44%。

2.6 产物的脂肪酸组成

原料和最优条件下得到的酯交换产物的脂肪酸组成如表3所示。

表3 原料及产物的脂肪酸组成 %

由表3可知：酯交换产物同时含有中碳链脂肪酸和长碳链脂肪酸，其中总脂肪酸含量最高的依次为月桂酸、棕榈酸和油酸，这与3种脂肪酸在原料油中的含量较高有关；sn-2位脂肪酸中含量最高的脂肪酸为棕榈酸，其次是月桂酸，主要是由于两种原料油脂的sn-2位分别含有高含量的棕榈酸和月桂酸，经sn-1,3位特异性脂肪酶催化的酯交换反应后，这两种脂肪酸在sn-2位仍保留较高的含量。

2.7 分子蒸馏纯化酯交换产物

采用NP-HPLC分析分子蒸馏前后产物中的游离脂肪酸(FFA)、甘油二酯(DAG)及甘油三酯(TAG)的含量，结果如表4所示。

表4 分子蒸馏前后产物的甘油酯组成 %

由表4可知，经过分子蒸馏之后，产物中的甘油三酯含量从86.07%提高到了97.22%，甘油二酯和游离脂肪酸含量大大降低，表明分子蒸馏对甘油二酯和游离脂肪酸具有良好的分离效果。

采用UPLC-Q-TOF-MS对分子蒸馏后产物的甘油三酯进行分析，结果如表5所示。

表5 分子蒸馏后产物的甘油三酯组成

续表5

甘油三酯[M+NH4]+(m/z)[DAG]+(m/z)含量/%OPL874.73575.47577.48601.492.99±0.24OMO848.73549.47549.47603.512.87±0.13PPL848.73575.47575.47551.490.54±0.09OPM822.69523.44549.47603.514.63±0.18PPM796.69523.44523.44551.463.19±0.11OOO902.77603.53603.53603.530.92±0.05OPO876.74577.48577.48603.513.98±0.15PPO850.73551.48577.48577.484.46±0.18PPP824.73551.47551.47551.471.99±0.11POS878.77577.51579.51605.531.00±0.07PPS852.76551.48579.51579.510.64±0.05OOS904.85605.53605.53603.530.35±0.07

由表5可知，产物中共有44种甘油三酯，与原料中的甘油三酯类型和含量有很大差异，除了部分原料油中原有的中碳链甘油三酯和长碳链甘油三酯外，还生成了大量的MLCT。根据文献[1-2,4-5]报道，OPLa是人乳脂中含量最高的MLCT，其在酯交换产物中的含量也最高，而原料中OPLa的含量很低，表明酯交换反应生成了OPLa，达到了预期的效果。其次，酯交换产物中还含有一些人乳脂中含量较高的其他MLCT，如LPLa、LLaO、OLaO、OMLa、OPCa、OLaLa等，其中LPLa、LLaO、OPCa是新生成的甘油三酯，椰子油中虽含有OLaO，但是含量极低，经过酯交换反应之后，OLaO的含量大幅提高。分子蒸馏之后，在人乳脂中含量较高的几种MLCT(OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OPCa、OMLa、LLLa、OLaLa、LLaLa)的总含量达到37.25%，其中LPLa、LLaO、OLaO的含量达到4.56%、3.76%和5.99%。

3 结 论

本研究以实验室制备的富含OPO和OPL的结构脂与椰子油为原料酶法合成与人乳脂中结构相似的中长碳链甘油三酯(MLCT)。得到的最佳反应条件为：底物摩尔比0.8∶ 1，反应温度65℃，脂肪酶NS40086添加量8%，反应时间6 h，无溶剂体系。最佳条件下得到的产物中MLCT含量为70.44%。产物经分子蒸馏纯化之后，甘油三酯的含量可达97.22%，其中OPLa、LPLa、OLaO、LLaO、OPCa、OMLa、LLLa、OLaLa、LLaLa均是人乳脂中含量较高的MLCT。产物中OPLa含量最高，达6.69%。这种模拟人乳脂MLCT结构的脂质有潜力应用于婴儿配方奶粉中，使婴儿配方奶粉的脂质组成更加接近人乳。