QuEChERS/气相色谱三重四级杆质谱法测定枸杞籽油中多环芳烃类物质

朱 捷，马桂娟，张 瑶，汤丽华

(宁夏回族自治区食品检测研究院，银川 750004)

枸杞籽为枸杞深加工的副产品，含有丰富的生物活性物质，其含油量为18%～22%，利用现代化萃取技术得到的枸杞籽油有效地保留了枸杞的多种功能成分，深受广大消费者的喜爱。但目前关于枸杞籽油中多环芳烃检测的研究较少，多集中于大豆油、菜籽油、花生油、橄榄油、玉米油等食用油脂[1-6]。

多环芳烃(PAHs)是由两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的一类中性或非极性有机化合物，其中的某些物质具有致突变性和致癌性[4]。国家食品安全标准GB 2762—2017中仅对苯并[a]芘作出了规定，其限量为10 μg/kg，欧盟对食用油脂中苯并[a]芘的限量为 2 μg/kg，还对4种PAHs(苯并[a]蒽、、苯并[a]荧蒽和苯并[a]芘)的总量作出了规定，不得超过10 μg/kg[5]。由于植物油中基质复杂，多环芳烃的检测相对比较困难，目前的研究多数采用高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)和气相色谱单四级杆质谱联用仪检测植物油中的多环芳烃[3,6-9]。但HPLC-FLD线性范围较窄，且不能在同一波长下同时检测多种多环芳烃。气相色谱单四级杆质谱联用仪虽然可以实现同时快速检测多种多环芳烃，由于单四级杆只能实现选择离子监测方式(SIM)，而这种方式会造成基质影响较大以及目标物分离不完全的情况。如何高效准确地对植物油中多环芳烃进行检测成为了目前研究的方向。

在检测食品中多环芳烃的残留时往往需要较为烦琐的前处理[10-15]。QuEChERS是快速(Quick)、简便(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的样品处理技术的缩写，现已被广泛使用[14]。本文参考QuEChERS技术进行样品前处理并结合气相色谱三重四级杆质谱联用(GC-MS/MS)分析法测定保健食品枸杞籽油中16种多环芳烃，探讨其可行性，为枸杞籽油产品相关标准的起草提供一定的技术支撑，对食品安全具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

枸杞籽油胶丸，市售；16种多环芳烃标准品(200 μg/mL，1.0 mL)，北京曼哈格生物技术公司；乙腈(色谱纯)，赛默飞世尔科技有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)，美国安捷伦科技公司；C18固相萃取填料，美国安捷伦科技公司；硅胶填料，迪马科技有限公司；食用油中苯并[a]芘质控样(QC-CO-702)，中国检验检疫科学研究院分析测试中心。吸附填料使用前均需用乙腈浸泡处理，烘干备用。

1.1.2 仪器与设备

GCMS-TQ8040气相色谱三重四级杆质谱联用仪，日本岛津公司；高速低温离心机，德国Sigma公司；全自动样品浓缩仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；涡旋混匀器，德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的提取与净化

称取枸杞籽油0.5 g于用乙腈浸泡过的10 mL玻璃管中，加入3.0 mL乙腈，涡旋1 min，8 000 r/min 离心10 min，取上清液，重复该步骤再次提取，合并2次上清液，35℃氮吹近干，用乙腈定容至1 mL。加入200 mg PSA及100 mg C18净化，涡旋1 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液供气质联用仪测定。

1.2.2 GC-MS/MS分析

色谱条件：HP-5MS UI毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度300℃；不分流进样；载气为氦气(纯度99.999%)，流速1.0 mL/min；程序升温为初始温度90℃，以20℃/min升至220℃，再以5℃/min升至320℃，保持2 min；自动进样，进样量1 μL。

建设单位向生产厂家派驻监造工程师，对原材料、生产过程、成品检验进行全过程监造。未经监造工程师签字，原材料不得使用，产品不得交付。监造工程师与建设、质量监督、检验等单位密切配合，从源头上严格控制生产厂家的生产质量。

质谱条件：接口温度280 ℃；电子轰击离子源(EI)；离子源温度250℃；溶剂延迟时间2.7 min；四级杆温度150℃；扫描方式为多反应检测扫描(MRM)方式。16种多环芳烃保留时间及特征离子对如表1 所示。

表1 16种多环芳烃保留时间和特征离子对

1.2.3 溶液配制

16种多环芳烃标准品先用乙腈稀释至2 μg/mL，再分别用基质提取液配制成1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的混合标准工作液。

2 结果与讨论

2.1 16种多环芳烃的分离情况

以枸杞籽油为基质，加标40 μg/kg，当采用选择离子监测方式(SIM)时干扰较大，本文采用多反应检测扫描(MRM)方式，检测结果如图1所示。

注：1.萘； 2.苊烯； 3.苊； 4.芴； 5.菲； 6.蒽； 7.荧蒽； 8.芘； 9.苯并[a]蒽； 10.； 11.苯并[b]荧蒽； 12.苯并[k]荧蒽； 13.苯并[a]芘； 14.茚并[1，2，3-c，d]芘； 15.二苯并[a，h]蒽； 16.苯并[g，h，i]芘。

图1 样品中添加16种多环芳烃的MRM图

由图1可以看出，采用MRM方式分析时基线稳定，16种多环芳烃可基本分离，基质干扰非常小，能够满足检测要求。

2.2 不同种类的吸附剂对回收率的影响

枸杞籽油中含有微量的水，大量的脂肪、有机酸、芳香烃类物质，目前较多研究中采用弗罗里硅土固相萃取柱、硅胶固相萃取柱以及C18固相萃取柱进行净化[16-18]，此步骤较为耗时。PSA可与金属离子产生螯合作用，可以有效去除脂肪酸、有机酸和一些极性色素及糖。C18的官能团含碳量10%，具有疏水作用，对中性、非极性的组分有吸附作用，如芳香油、脂溶性维生素。硅胶填料具有很强的吸附力，可以去除水、色素等物质。本文参考GB 5009.265—2016《食品安全国家标准 食品中多环芳烃的测定》以及市售QuEChERS试剂盒中净化材料的种类及用量(100 mg PSA、100 mg C18及100 mg硅胶)，通过对枸杞籽油样品进行加标回收实验(n=3)，研究了3种常用吸附剂组合对多环芳烃回收率的影响，结果见表2。

表2 不同吸附剂组合对多环芳烃回收率的影响 %

由表2可以看出，采用PSA及C18净化后16种多环芳烃的回收率在63.2%～109.3%之间，而用PSA及硅胶净化后蒽、荧蒽、芘、、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽回收率在60%～110%之间，但萘、苊烯、苊、芴、菲等的回收率仅为30%左右，这可能是由于硅胶会吸附萘、苊烯、苊、芴、菲等相对分子质量较小的物质。用C18及硅胶净化后多环芳烃的回收率明显降低，大部分在60%以下，这可能是由于净化不完全导致其他杂质对目标物造成影响。所以本实验在样品前处理中使用PSA与C18的组合方式进行净化。另外，对PSA及C18的用量进行了优化，将PSA的用量由100 mg增加到200 mg后，净化后的样品颜色较优化前澄清，16种多环芳烃的回收率较优化前明显提高，这可能是由于PSA的增加吸附了更多的色素及脂肪类物质，使得多环芳烃的回收率提高，所以本文采用200 mg PSA与100 mg C18的组合方式进行实验。

2.3 提取次数及乙腈体积对回收率的影响

在对样品前处理过程进行优化时，分别研究了3、5 mL以及10 mL乙腈进行提取，结果表明采用大体积乙腈进行提取时，仅有萘、苊烯、苊等少部分多环芳烃的回收率较高，其余物质的回收率变化不显著，同时采用大量的乙腈也增加了吸附材料的使用量以及氮吹的时间，造成资源的浪费，所以采用3 mL乙腈为宜。对乙腈提取1次、2次以及3次时多环芳烃回收率进行比较，结果如表3所示。

表3 不同提取次数对多环芳烃回收率的影响 %

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围及回收率

本研究采用外标法定量，以各标准品的质量浓度为横坐标(X)，各化合物响应值的峰面积为纵坐标(Y)建立标准曲线。加标回收实验中采用直接向阴性枸杞籽油样品中加入混合标准溶液的方式进行检测，且添加不同质量浓度的标准品，其中添加的低质量浓度水平为40 μg/kg，高质量浓度水平为200 μg/kg。标准曲线回归方程、相关系数(R2)及加标回收率见表4。由表4可以看出，16种多环芳烃在1～200 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数(R2)均大于0.998，添加低、高质量浓度的标准品后16种多环芳烃的回收率在60.04%～119.00%之间，回收率的RSD为2.92%～13.03%。各目标化合物峰面积的RSD为0.6%～5.5%(n=6)，说明该方法重现性好。满足GB/T 27404—2008的要求。

表4 16 种多环芳烃标准曲线回归方程、相关系数及加标回收率(n=6)

2.4.2 检出限、定量限及基质效应

孟繁磊等[19]采用标准曲线斜率比值的方法评价基质效应情况，若比值在0.85～1.15之间认为基质效应不明显，本文参考其方法进行比较。用空白样品为基质，添加不同量的混合标准品后测定，以信噪比(S/N)≥3 确定方法的检出限(LOD) ，以信噪比(S/N)≥10确定方法的定量限(LOQ)，16种多环芳烃的检出限、定量限及基质效应见表5。

表5 16种多环芳烃的检出限、定量限及基质效应

由表5可知，16种多环芳烃的基质效应在85.1%～114.2%之间，可以认为基质效应不明显。用外标法定量测定，16种多环芳烃的检出限在0.2～3.5 μg/kg之间，定量限在0.7～11.5 μg/kg之间。

2.5 质量控制措施

本研究使用的玻璃器皿在使用之前均使用乙腈浸泡24 h后烘干，以消除玻璃器皿中多环芳烃类物质的污染。PSA及C18使用之前分别称取10 g，加入30 mL乙腈超声30 min，弃去上清液，重复该步骤3次，吸附填料经烘干后备用。这样可以有效减少外源多环芳烃的污染。

本研究还发现，样品提取后于35℃氮吹近干的过程中氮气流量过大会导致4种多环芳烃(萘、苊烯、苊、芴)的回收率偏低，而对其余的12种多环芳烃影响较小，其中萘、苊烯、苊、芴的回收率仅为正常值的50%左右。这可能是由于萘、苊烯、苊、芴的熔点较低，且易挥发，如果氮气流量过大，粘在管壁上的物质会被气流吹出，导致回收率下降。所以在氮吹时应注意控制气流。同时在氮吹时也应注意氮吹温度，当氮吹温度在40～55℃时管中残渣会紧紧吸附在管壁上不易复溶，造成萘、苊烯、二苯并[a,h]蒽等物质回收率偏低，这可能是由于油性物质包裹多环芳烃吸附在管壁上引起的。

2.6 质控样品的检测

本研究中除了进行加标回收实验外还将购买的苯并[a]芘质控样以及历年检测中发现的苯并[a]芘超标的枸杞籽油作为普通样品进行检测，测得该质控样中苯并[a]芘的含量为10.7 μg/kg，在质控样的参考范围值(11.3±1.3)μg/kg之内。苯并[a]芘超标的枸杞籽油复测结果的平均偏差在1.9%～3.2%之间。说明该法可靠有效。

2.7 QuEChERS前处理的优势

GB 5009.265—2016《食品安全国家标准 食品中多环芳烃的测定》中关于油脂含量较高的样品的前处理采用乙腈提取，正己烷复溶，弗罗里硅土固相萃取柱净化，正己烷-二氯甲烷洗脱，乙腈定容等过程，平均处理一个样品需用1.5～2 h，且成本较高、毒害较大，同时萘、苊烯、苊、芴、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]芘的回收率仅为30%～40%，其余多环芳烃类物质的回收率在92%～107%之间。采用本文中QuEChERS前处理，平均处理一个样品用时0.5 h左右，省时省力，16种多环芳烃的回收率在60.04%～119.00%之间，回收率较高。

3 结 论

建立了同时检测保健食品枸杞籽油中16 种多环芳烃的QuEChERS/GC-MS/MS方法。采用含200 mg PSA和100 mg C18吸附填料粉进行净化，净化后采用GC-MS/MS进行分析测定。在优化条件下，16种多环芳烃分离度良好，在1.0～200 ng/mL范围内线性关系良好。通过QuEChERS的样品前处理方法能获得较高的回收率，其回收率在60.04%～119.00%之间，回收率的RSD为2.92%～13.03%;方法的检出限在0.2～3.5 μg/kg之间，定量限在0.7～11.5 μg/kg之间。该法可显著降低实验成本，且降低了对实验者及环境的污染风险；采用MRM方式显著提高了检测的准确性和选择性，有效地排除了干扰；该方法经济、可靠，并且简单、快速，能够满足保健食品枸杞籽油中多环芳烃在日常检测中的要求。