基于磁珠的核酸快速提取和纯化

张翠真， 袁小龙， 陈志和， 毛振方， 简少卿,2， 赵大显，2

(1. 南昌大学 生命科学学院， 南昌 330031； 2. 江西省水产动物资源与利用重点实验室， 南昌 330031)

核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测、物种鉴定、物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统进化等常用研究手段之一。能否提取出高质量的核酸则是分子生物学实验中的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。因此，核酸提取是分子生物学最关键的方法之一[1]。

随着分子生物学的广泛应用，对核酸提取技术也提出了新的要求，高效、便捷、环保、大通量、自动化成为核酸提取技术发展的主流方向。从第1代化学法[2-6]，如酚-氯仿法、Trizol法，到第2代吸附柱法[2]，以及近年发展起来的第3代磁珠法[7-11]，其提取技术和效率不断地改进优化。

本研究通过纳米磁珠法提取纯化细菌基因组DNA、总RNA和质粒DNA，并与试剂盒法和Trizol法提取效果进行比对分析，以期获得最佳的提取方法，为核酸提取技术提供理论数据。

1 材料与方法

1.1 材料

SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒购自上海生工，Universal Genomic DNA Extraction Kit购自Takara，Trizol试剂购自ABI。细菌 RNAOμT购自北京天恩泽基因科技有限公司。

PCR所需引物序列上游(5′-CAATATCAGCGATGCCGAACGTAT-3′)和下游引物(5′-TACCATCACCTACCACCGAGATAA-3′)均由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA提取

试剂盒法按照Universal Genomic DNA Extraction Kit说明书要求操作。

纳米磁珠法提取大肠杆菌基因组DNA：取2 mL大肠杆菌DH10B(E.coliDH10B)培养液，9000 r/min离心，加入500 μL Lysis buffer II，混匀，室温裂解5 min，加入200 μL氯仿/异戊醇(24∶ 1)，振荡30 s，13 000 r/min离心5 min；取200 μL上清液加入200 μL磁珠悬液，振荡混匀，室温吸附5 min，静置 20 s，吸出上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混匀，静置 20 s，吸出上清液；加入70 μL TE buffer，混匀，室温放置10 min，静置20 s，保存备用；测定核酸样品的A260，A260/A280，计算回收率，1%的琼脂糖凝胶电泳测定基因组DNA质量。

1.2.2 PCR 检测

将两种方法提取的基因组DNA稀释至30 ng/μL进行PCR扩增。

25 μL PCR反应体系：5 μL 5×PCR buffer，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)，0.5 μL下游引物(10 μmol/L)，0.5 μL dNTP mix(各2.5 mmol/L)，1 μL基因组DNA(30 ng/μL)，15.5 μL去离子水，0.5 μLTaqDNA polymerase(5 U/μL)，混匀。

PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃再延伸5 min，PCR反应完成后，将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳观察。

1.2.3 PCR 产物纯化

试剂盒法按照SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒说明书操作。

纳米磁珠法纯化PCR产物：100 μL PCR反应液中加入500 μL buffer PB、100 μL磁珠悬浮液和500 μL无水乙醇，混匀，室温吸附5 min，静置 20 s，吸出上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混匀，静置 20 s，吸出上清液后室温晾干15 min；加入 100 μL TE buffer，混匀，室温吸附10 min，静置 20 s，保存备用。1%的琼脂糖凝胶电泳检测，测定纯化后DNA样品浓度，计算回收率。

1.2.4 DNA胶回收

试剂盒法按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作。

纳米磁珠法胶回收DNA：从琼脂糖凝胶中切下含目标片段的胶块、称重。加4倍胶重的buffer PG，50℃水浴溶解；加入100 μL 磁珠悬浮液和buffer PG等体积的无水乙醇，混匀，室温吸附5 min，静置 20 s，吸出上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混匀，静置 20 s，吸出上清液，晾干 10～15 min。加入 100 μL TE bμffer，混匀，室温吸附10 min，静置 20 s，将 DNA 溶液转移至新的EP管中保存。测定胶回收后DNA样品的浓度，计算回收率，1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 质粒DNA提取

试剂盒提取法按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明书操作。

纳米磁珠法提取质粒DNA：将携带有PBV220质粒的E.coliDH10B接种于5 mL Amp抗性的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min 振荡培养过夜；取4 mL菌液到EP管中，9000 r/min离心，加入250 μL Buffer P1，吹打悬浮，加入250 μL Buffer P2，混匀，室温裂解3 min；加入350 μL Buffer P3，混匀，室温静置1 min，13 000 r/min离心5 min，取上清液，加入400 μL 无水乙醇和200 μL MNPS悬液，振荡混匀，室温吸附5 min，静置 20 s，去除上清液，加入 500 μL 75%乙醇，混匀，静置 20 s，去除上清液，室温晾干15 min，加入 70 μL TE buffer，混匀，室温放置10 min，静置 20 s，将 DNA 溶液转移至新的EP管中保存。测定核酸样品的浓度、A260/A280，1%的琼脂糖凝胶电泳测定质粒DNA样品的完整性。

1.2.6 质粒酶切检测

用去离子水将1.2.5中两种方法提取的质粒DNA稀释至50 ng/μL。

50 μL酶切反应体系：5 μL 10×QuickCut Buffer，10 μL质粒DNA(50 ng/μL)，1 μL QuickCutHind III，ddH2O补足50 μL。37 ℃孵育3 h后，将酶切产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察。

1.2.7 细菌总RNA提取

试剂盒和Trizol法按说明书操作。

纳米磁珠法提取E.coliDH10B总RNA：离心收集2 mL 新鲜培养的细菌，加入500 μL Lysis buffer I，混匀，室温裂解5 min；加入200 μL氯仿/异戊醇(24∶ 1)，振荡30 s，13 000 r/min离心5 min；取200 μL上清到一新的EP管中，加入200 μL MNPS悬液，振荡混匀，室温吸附5 min，静置 20 s，去除上清液；加入 500 μL 75%乙醇，混匀，静置 20 s，去除上清液，室温晾干15 min；加入 70 μL TE buffer，混匀，室温洗脱10 min，静置 20 s，将RNA溶液转移至新的EP管中，-80℃保存。测定RNA样品的浓度、A260/A280，1%的琼脂糖凝胶电泳测定总RNA样品的完整性。

2 结果

2.1 两种提取细菌基因组DNA方法的比较

本研究用磁珠法和试剂盒法分别从2 mL菌液中提取到83.2 μg和35.8 μg基因组DNA，A260/A280分别为1.83和1.84，两种方法提取的基因组DNA都比较完整，未发生降解，没有蛋白污染，用磁珠法提取的基因组DNA条带(Lane 2)比试剂盒法提取的(Lane 1)更亮(图1)。

M：DL2000 Marker； 1：试剂盒提取的DNA； 2：磁珠法提取的DNA

图1E.coliDH10B基因组DNA电泳图

Figure 1 Genomic DNA electrophoresis ofE.coliDH10B

2.2 PCR扩增结果

用两种方法提取的基因组DNA分别作为模板,进行PCR扩增，结果均能扩增出大小1 kb左右的目的条带(图2)。但磁珠法提取的DNA扩增后显示出唯一一条清晰可见的条带(Lane 1)，而以试剂盒提取的DNA作为模板时，PCR产物中有少量微弱的非特异性条带(Lane 2)。

M：DL2000 Marker； 1：磁珠法提取的基因组DNA作为PCR模板； 2：试剂盒提取的基因组DNA作为PCR模板

图2E.coliDH10B苏氨酸操纵子基因片段PCR产物电泳图

Figure 2 Electrophoretsis of PCR product of suanine manipulation subgene fragment ofE.coliDH10B

M：DL2000 marker； 1：磁珠法直接纯化的PCR产物； 2：试剂盒直接纯化的PCR产物； 3：未纯化的PCR产物

图3纯化后的PCR产物电泳图

Figure 3 Electrophoresis of PCR products after purification

2.3 两种PCR产物纯化方法比较

用磁珠法和试剂盒分别对5.2 μg的PCR产物进行直接纯化，纯化后A260/A280分别为1.91和1.86，纯化后的产物质量分别为4.6 μg和4.4 μg，经计算，回收效率分别达到88.5%和84.6%，且磁珠法直接纯化的PCR产物(Lane 1)比试剂盒直接纯化的PCR产物(Lane 2)亮(图3)。

2.4 两种DNA胶回收方法比较

实验使用磁珠法和试剂盒法分别对3.0 μg的PCR产物DNA进行电泳并胶回收，回收后的DNAA260/A280分别为1.87和1.88，回收后的DNA质量分别为2.3 μg和2.4 μg，经计算，回收效率分别达到76.7%和80.0%，回收后电泳结果如图4所示。

M：DL2000 marker； 1：磁珠法胶回收的DNA； 2：试剂盒胶回收的DNA； 3：未进行胶回收的DNA

图4胶回收后的DNA电泳图

Figure 4 The DNA electrophoresis of the recovered glue

2.5 两种质粒DNA提取方法比较

实验通过磁珠法和试剂盒法分别从2 mL菌液中提取到9.5 μg和10.8 μg质粒DNA，A260/A280分别为1.84和1.82。实验使用的PBV220质粒大小为3666 bp，其中有3个Hind III酶切位点，经Hind III酶切后，理论上会产生大小依次为2727 bp、815 bp、125 bp的DNA条带，但是实际操作过程中，125 bp的DNA片段由于质量小，很难在电泳图谱上被观测到。电泳图谱显示(图5)，两种方法提取的质粒电泳条带指示的大小小于其真实大小，试剂盒法提取的质粒(Lane 4)比磁珠法提取的质粒(Lane 3)条带更亮，磁珠法提取的质粒(Lane 3)约80%为超螺旋结构，另一部分为线性或开环质粒。试剂盒法提取的质粒(Lane 4)约90%为超螺旋结构，另外一部分为开环质粒。

M：1 kb DNA ladder； 1：磁珠法提取的质粒Hind III酶切产物； 2：试剂盒提取的质粒Hind III酶切产物； 3：磁珠法提取的质粒； 4：试剂盒提取的质粒

图5PBV220质粒DNA及其酶切电泳图

Figure 5 PBV220 plasmid DNA and its enzymatic electrophoresis

2.6 3种细菌总RNA提取方法比较

磁珠法、试剂盒与Trizol法提取的细菌总RNA浓度分别为138、94和105 ng/μL，A260/A280分别为1.89、1.88和1.74。由图6可知，3种方法提取的总RNA有3条带，从上到下依次为23S rRNA，16S rRNA 和5S rRNA。其中23S rRNA 的亮度约是16S rRNA 的2倍，且条带清晰透亮，无明显的拖尾现象，说明RNA 的完整性很好。

M：DL2000 marker； 1：磁珠法提取； 2：试剂盒提取； 3：Trizol提取

图6E.coliDH10B总RNA电泳图

Figure 6 Total RNA electrophoresis ofE.coliDH10B

3 讨论

表面修饰的磁性纳米粒子作为新型的功能材料, 具有磁响应性和生物安全性[12]。在生物医药方面已得到广泛应用。磁珠法提取核酸是利用磁性纳米粒子与核酸结合, 在外磁场的作用下达到分离纯化核酸的目的[13]。Qie等[14]应用聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM对DNA的结合效应将其修饰在铁磁性纳米粒子表面, 应用修饰后的粒子提取DNA, 此方法较为新颖。对比各种传统方法证明磁珠修饰法的提取效率高及过程较为便捷[15]。

由磁珠法和试剂盒法提取基因组DNA的A260/A280值在1.8～2之间可知，两种方法提取的基因组DNA均没有蛋白质污染，且磁珠法从2 mL菌液中提取的基因组DNA量多于试剂盒法，从而得出磁珠法提取效率高于试剂盒法。从图1中两种提取方法的亮度也可知，磁珠法提取效率高于试剂盒法，同时两种方法提取的基因组DNA都比较完整，未发生降解。但磁珠法提取的DNA中混有少量的RNA,可能是由于细胞裂解液中没有添加RNase A所致。实验所建立的方法可以简便而高产地提取到基因组DNA，说明本研究的方法具有良好的应用前景。

实验采用PCR技术检验核酸的纯度。图2中试剂盒法提取的基因组DNA扩增后的条带2出现杂带，表明模板DNA不纯，其中的杂质对TaqDNA polymerase或者引物产生了干扰作用，从而降低了PCR反应的特异性。因此相比试剂盒法，磁珠提取法得到的基因组DNA纯度更高。

PCR产物一般都含有过量的引物、dNTP、DNA聚合酶和一些离子，这些成分的存在，直接影响后续的酶切、测序、杂交、克隆等反应，因此有必要将其除去。而这两种方法提取的产物与不提纯之前条带相比相差不大，说明这两种方法都能较好地纯化PCR产物。

在分子生物学实验中，很多情况需要利用琼脂糖凝胶电泳观察、纯化和回收DNA片段，特别是在进行基因的预测、筛选、克隆和转化及不同类型DNA片段进行纯化和回收，然后克隆和测序，需要准确、简便、快速、经济的琼脂糖凝胶DNA回收方法[16]。

质粒DNA提取效率及质量关系到分子克隆的全过程，建立高效而快速的质粒DNA提取方法对提高分子生物学研究具有重要意义[17]。传统的质粒DNA提取方法大多基于离心、沉淀或色谱分离，普遍存在操作时间长、离心次数多、接触有毒试剂及成本偏高等特点[18]。

两种方法提取的质粒都能被限制性内切酶Hind III完全切开，酶切后的电泳条带与理论相符，进一步说明提取到的质粒DNA纯度较高，没有抑制内切酶活性的杂质存在。

RNA是生物体内的遗传物质，不仅可以是信息的携带者，还可以是功能的执行者，在生物体内，RNA执行着多种代谢功能。获取高质量的RNA与分子生物学研究密切相关[19-20]，因此，如何使提取的RNA纯度变得越好，浓度越高，成为深入研究的关键。由提取的RNA浓度可知磁珠法提取的RNA浓度最高，由Trizol法提取RNA的A260/A280值小于1.8可知，其提取的RNA纯度较低。但磁珠法和试剂盒提取到的总RNA中有基因组DNA的污染，不过这些DNA能通过加入DNaseI的方法除去，而Trizol法不存在基因组DNA污染的情况，但Trizol试剂中加入了苯酚，对人体有毒性，并且苯酚的残留将影响后续实验。相比之下，磁珠法和试剂盒法更加环保安全。

4 结论

采用磁珠法和试剂盒法与Trizol法对核酸进行提取与纯化。与试剂盒法和Trizol法相比，磁珠法在细菌基因组DNA和RNA提取、PCR产物检测及纯化中效率更高；而在PCR产物回收和质粒DNA的提取中，效率低于试剂盒法，质粒酶切效果与试剂盒法无差异。结果表明，纳米磁珠法相比试剂盒法和Trizol法在核酸提取纯化效果上更佳。