红曲霉LovD基因的克隆及转基因高产洛伐他汀菌株筛选

沈小瑞， 王钰， 陈达伟

(安徽大学 资源与环境工程学院， 合肥 230601)

红曲霉(Monascusspp.)在中国的应用有着很久远的历史，在工业、食品、医学等方面都占据着重要作用[1-3]。红曲霉可产多种对人体有益的次生代谢产物，如γ-氨基丁酸、麦角甾醇、洛伐他汀等。其中洛伐他汀是当今世界治疗高血脂症的有效药物之一，具有多种药理作用[4-6]。常见产洛伐他汀真菌有红曲霉，土曲霉与青霉菌，但产量不适宜大规模生产，提高洛伐他汀的产量具有重要意义。酰基转移酶LovD是洛伐他汀的生物合成中一个重要酶， LovD 催化 Monacolin J(洛伐他汀前体物)进行转酰基作用，合成洛伐他汀[7]。所以研究LovD基因对洛伐他汀的生物合成具有重要意义[8]。

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)是一种革兰氏阴性菌[9]，有将自身部分DNA转移到宿主基因组中的能力，在基因工程和分子生物学基础研究中具有重要作用[10]。De Groot等[11]利用根癌农杆菌转化黑曲霉，为丝状真菌的遗传转化开创了新的研究方法。目前，根癌农杆菌已被成功运用于食药用真菌、动植物致病性真菌等多种真菌的遗传转化。据报道，已有超过125种真菌通过此方法完成遗传转化[12-15]，但对红曲霉的农杆菌遗传转化研究相对较少。

本研究以紫外诱变后得到的高产洛伐他汀菌株M120-1为出发菌株，通过RT-PCR技术克隆LovD基因序列，构建过量表达载体，使用根癌农杆菌介导红曲霉遗传转化，筛选阳性菌株，通过高效液相色谱法筛选高产洛伐他汀菌株，并对其进行遗传稳定性分析，以期为研究红曲霉产洛伐他汀分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

红曲霉M120-1由本学院资源植物保护与利用研究组通过紫外诱变筛选及保存[16]。大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

洛伐他汀标准品购自Sigma公司。TaqPlus酶、胶回收试剂盒购自上海生工。pMD18-T载体、pRI101-AN表达载体(启动子为 CaMv 35S，终止子为 NOS)购自TaKaRa公司。乙酰丁香酮，卡那霉素等均为分析纯，购于上海生工公司。PCR引物由上海生工合成。

1.1.3 培养基

PDA培养基：称取200 g土豆切块，煮沸30 min后加入2% 葡萄糖，1% 琼脂粉，定容至1 L，pH值自然， 121℃高压灭菌30 min。

液体发酵培养基：100 mL甘油，20 mL玉米浆，10 g硝酸钠，10 g乙酸钠，5 g甲硫氨酸，5 g KH2PO4，2 g MgSO4·7H2O，定容至1 L，pH值自然， 121℃高压灭菌30 min。。

1.2 试验方法

1.2.1 红曲霉总RNA提取及cDNA第一链合成

称取1 g红曲霉，加入 1 mL RNAiso Reagent，振荡混匀，4 ℃ 12 000 r/min，离心 5 min。吸取上清液平均分至 2个离心管中。加入 1/5 体积的氯仿。乳化静置后离心，加入等体积的异丙醇，混匀静置后离心，加入 75%的乙醇 1 mL，摇匀离心，弃去乙醇。RNA沉淀的清洗，待 RNA 沉淀完全溶解后于-80 ℃保存。1.5%甲醛变性凝胶电泳检测。

RT-PCR反应体系:上样缓冲液4 μL，RNA 2 μL，随机引物1 μL，反转录酶1 μL，去RNA 酶水12 μL，共20 μL，37 ℃ 15 min。

1.2.2 表达载体构建

胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，进行连接转化。将回收、纯化后得到的目的片段与pRI101-AN表达载体进行过夜连接。热刺激转化感受态细胞，蓝白斑法筛选阳性菌株，将克隆片段交由上海生工进行测序。把带有LovD基因的质粒，整合进根瘤农杆菌中，采取PCR检测分析转化菌株。

1.2.3 红曲霉遗传转化

将红曲霉菌株接种至PDA培养基，30 ℃培养15 d后，制备孢子悬液，用无菌水将孢子稀释浓度为1×105个/mL。诱导培养农杆菌时诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度为140 μmol/L，根癌农杆菌的OD600值为0.6，农杆菌和红曲霉孢子于30 ℃共培养3 d。对其红曲霉LovD基因进行遗传转化共得到1000个左右的转化子，随机挑选12个转化子进行PCR检测。

1.2.4 高产洛伐他汀菌株筛选

取2 mL发酵液于6 mL乙酸乙酯中，超声30 min，6000 r/min，离心10 min。将上清液于微孔滤膜过滤， HPLC检测分析。检测条件：波长238 nm，梯度洗脱，进样量10 μm，柱温35 ℃，流动相：乙腈和0.1%磷酸缓冲液。标准曲线方程为y=3×10-8x+0.003 (R2=0.9968)，其中x表示峰面积，y表示为浓度mg/mL。

1.2.5 遗传稳定性分析

将筛选出的高产洛伐他汀转化菌株连续培养9代，测定1、3、5、7及9代的洛伐他汀产量，以其产量为标准检测其遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 红曲霉总RNA提取

图1 红曲霉总RNA主要脂糖凝胶电泳

吸取1 μL红曲霉总RNA样品，用1.5%甲醛变性凝胶电泳检测，总RNA的3条带非常明亮，其中28S rRNA和18S rRNA两个条带亮度好，条带边缘比较分明，且28S rRNA大概为18S rRNA的两倍的亮度，说明提取的质量较高，没有降解和DNA污染，满足用来进行后续实验。

2.2 红曲霉转化子的PCR鉴定

(Marker：GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder, 75、 200、 300、 400、 500、 700、 1000、 1500、 2000、 3000、 4000、 5000、 7000、 10 000、 20 000 bp)

图2红曲霉转化子的PCR鉴定结果

Figure 2 PCR assay results ofMonascustransformants

根据遗传转化体系获取转化子1000个左右，随机挑选12个转化子，1-14分别代表：水，原始菌株，MD-1，MD-2，MD-3，MD-4，MD-5，MD-6，MD-7，MD-8，MD-9，MD-10，MD-11，MD-12进行PCR鉴定，如图所示，12个转化子中有10个出现条带，水和原始菌株中没有出现明显的条带，故得到证明T-DNA成功导入到红曲霉基因组中。

2.3 红曲霉洛伐他汀的产量测定

表1 红曲霉洛伐他汀的产量测定

注：P≤0.05

对初步筛选的10个转化子进行培养，30 ℃培养7 d，通过HPLC测定洛伐他汀产量，方差分析结果如表1所示，其中9株的洛伐他汀产量高于出发菌株[16]，且MD-5的产量最高，与其他9个菌株在P≤0.05表现出显著性差异。MD-5的洛伐他汀产量为0.55 mg/mL，比出发菌株高出63%。

2.4 转化菌株遗传稳定性

对洛伐他汀产量最高的红曲霉转化菌株MD-5进行传代培养，分析其遗传稳定性，结果如表2所示，子代相对于第 1 代产量略有下降，但每组之间以及和一代对比没有表现出显著性差异，基本保持产量的稳定性， MD-5转化菌株表现出良好的稳定性。

表2 高产洛伐他汀菌株的稳定性分析

3 讨论

常见产洛伐他汀真菌有红曲霉、土曲霉与青霉菌，但其产量都不是很高，并不适宜进行大规模生产。目前已通过菌种改良、发酵工艺优化及基因工程技术等方法提高洛伐他汀产量[17-18]。

通过根癌农杆菌介导的红曲霉遗传转化，获得的MD-5菌株洛伐他汀产量为0.55 mg/mL。根瘤农杆菌导入的LovD过量表达载体是否与染色体发生重组，或形成独立的质粒有待进一步研究。