2008-2018年北京市伤寒、副伤寒沙门菌病原学特征

曲梅 黄瑛 张新 吕冰 贾蕾 田祎 王全意

伤寒、副伤寒是由伤寒和副伤寒(甲、乙、丙血清型)沙门菌引起，经粪口途径传播，常引起急性肠道传染病的暴发，属于乙类传染病，一直是北京市重点监控的传染病之一。随着卫生环境的改善及综合防治措施的落实，北京市伤寒、副伤寒的发病得到有效控制，维持在较低水平，但仍有散发病例持续存在[1,2]。近年来，在抗生素的选择压力下，沙门菌耐药现象日趋严重[3]。为更好地开展监测和防控工作，了解伤寒、副伤寒菌型变迁和流行特征，现将北京市2008-2018年伤寒、副伤寒沙门菌临床分离株进行血清型、耐药性和分子分型分析。

1 材料与方法

1.1菌株来源 2008-2018年，北京市肠道门诊监测系统采集的腹泻患者标本，经各区疾控中心进行分离培养，初步鉴定为伤寒、副伤寒沙门菌的散发临床分离株56株，及一起输入性伤寒暴发疫情的9株菌，共计65株。

1.2方法

1.2.1菌株鉴定： 伤寒、副伤寒沙门菌的分离培养参照卫生部行业标准WS280-2008附录A进行。将各区上送的可疑伤寒、副伤寒沙门菌转种于营养琼脂培养基上过夜培养，采用法国梅里埃公司VITEK2-Compact全自动微生物鉴定系统进行系统生化鉴定。

1.2.2血清分型试验： 针对沙门菌群(A～F)多价血清、菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和Vi抗原进行血清凝集试验。方法为挑取三糖斜面上少量菌苔与A～F多价抗血清在室温下进行玻片凝集，1 min 内出现凝集颗粒为阳性；按同样方法与O单价抗血清进行逐一凝集来确定O抗原，根据确定的O抗原进行相应的H多价和单价血清凝集以确定最终血清型。玻片凝集时需设生理盐水对照。沙门菌诊断血清为丹麦SSI血清研究所产品，均在有效期内使用。

1.2.3药敏试验： 采用最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration，MIC)法，使用上海星佰生物技术有限公司生产的革兰阴性需氧菌药敏检测板，药物应用环丙沙星(CIP)、链霉素(STR)、氨苄西林(AMP)、氯霉素(CHL)、磺胺异噁唑(SUL)、复方新诺明(SXT)、萘啶酸(NAL)、阿莫西林-克拉维酸(AUG)、头孢曲松(CRO)、强力霉素(DOX)、庆大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)、四环素(TET)、头孢西丁(FOX)、头孢吡肟(FEP)以及亚胺培南(IMP)16种药物进行沙门菌耐药性检测，其结果与美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)2016年标准比较，以大肠埃希菌(ATCC25922)做为质控菌株。对三种及以上抗生素耐药，既为多重耐药(multidrug resistance, MDR)。

1.2.4脉冲场凝胶电泳(PFGE)： 参照PulseNet制定的沙门菌脉冲场电泳标准分型方法。沙门菌标准株H9812做为分子量标记。内切酶 XbaI(40 U)，37 ℃酶切3 h。电泳条件：电压6 v/cm，脉冲时间从2.2～63.8 s，线性转换，转换角度120°，电泳时间19 h，电泳温度14 ℃。脉冲场凝胶电泳仪为Bio-Rad，CHEF III；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel-DOCXR。内切酶购自New England公司。采用国家致病菌识别网信息化平台系统对电泳图像进行处理、网络化数据传输和比对分析。聚类树状图根据非加权配对算术平均法(unweighted pair-group method using arithmetic averages，UPGMA) 构建。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0软件和WPS 2016专用版对数据进行频数和百分构成分析。

2 结果

2.1血清分型及年龄组情况 2008-2018年，伤寒、副伤寒沙门菌株共65株，分布于北京市16个区。男女比例1.2∶1(35/30)，以男性居多。其中，伤寒沙门菌24株，占36.9%，主要分布于2008、2010、2013和2015-2017年，平均每年2～5株，2018年，有一起输入性伤寒暴发分离到9株菌。甲型副伤寒沙门菌7株，占10.8%，主要分布在2013-2015和2017年；乙型副伤寒沙门菌20株，占30.8%，主要分布在2009-2011和2013-2016和2018年；丙型副伤寒沙门菌14株，占21.5%，主要集中在2009-2012年。年龄分布0～10岁组和31～40岁组最多，均占24.6%，其次是41～50岁组和21～30岁组，分别占18.5%和13.8%，11～20岁组最少占4.6%(表1)。

2.2药敏试验结果 65株伤寒、副伤寒沙门菌对16种抗生素的敏感和耐药程度不同(表2)。伤寒沙门菌对萘啶酸的耐药率最高为20.8%，其次为链霉素和磺胺异噁唑，而对头孢类抗生素、阿莫西林-克拉维酸、强力霉素，阿奇霉素和亚胺培南等均100%敏感。甲型副伤寒沙门菌对氟喹诺酮类抗生素萘啶酸和环丙沙星的耐药率分别为100.0%和57.1%，对氯霉素和磺胺异噁唑的耐药率均为14.3%，对其他抗生素均敏感。乙型和丙型副伤寒沙门菌对磺胺异噁唑的耐药率分别为20.0%和35.7%，对其它抗生素的耐药率均低于10%。临床上治疗腹泻常用的头孢菌素、环丙沙星(除甲型副伤寒外)，以及氨基糖甙类庆大霉素对4种血清型沙门菌普遍较敏感，敏感率均>75%。多重耐药分析显示，甲型副伤寒的多重耐药最明显，耐药率达到28.6%，存在对8种抗生素的联合耐药。伤寒沙门菌多重耐药率最低，为4.2%。

表1 伤寒、副伤寒沙门菌株不同年龄组、性别及血清型分布

表2 2008-2018年伤寒、副伤寒沙门菌耐药情况

2.3PFGE分子分型 用限制性内切酶XbaI 将伤寒、乙型副伤寒和丙型副伤寒沙门菌共58株菌，全基因组酶切后，每株菌产生12～20条电泳条带，各片段分子量为20～700 kb。各菌株图谱间DNA条带数量和位置完全相同为同一型别，若有1条或1条以上的条带差别，即判为不同的型别。58株菌分为34种带型(Sal.BJ001～Sal.BJ034)，经聚类分析，总体相似系数在32.2%～100%，带型分散，无明显优势型别(图1)。其中2018年的9株伤寒沙门菌带型一样Sal.BJ0032，为一起输入性暴发，占15.6%，但与其它型别存在明显差异,有5种型别分别包含3株菌，各占5.2%,6种型别分别包含2株菌，各占3.4%。虽然这些菌株克隆来源一样，但病例均来自不同的区，不同的年份，没有流行病学上的关联。其余22种带型都只有1株菌。

3 讨论

3.1全球范围伤寒或副伤寒流行与菌株的优势血清型有关，存在变迁替换现象[4]。此次分析发现,2008-2018年，北京市肠道门诊监测系统腹泻患者粪便标本中伤寒、副伤寒沙门菌维持在较低水平。2008-2012年，伤寒沙门菌和乙型、丙型副伤寒沙门菌均有流行或交替出现，但2013年以后，则主要以伤寒沙门菌和乙型副伤寒为主，偶有甲型副伤寒的散在菌株。据文献报道，甲型副伤寒多是在沿海地区、西南部省份和东部省份高发，江西、浙江、广西、云南等地多次出现暴发疫情，并在长时间持续扩散[5]。此次研究结果显示，65株伤寒副伤寒沙门菌以0～10岁组和31～40岁年龄组居多，与文献报道一致[1,3]。世界卫生组织一直认为5～15岁组是伤寒、副伤寒的高发年龄组[4]，这与低龄段儿童，免疫系统发育不完善，自身抵抗力较弱，容易受细菌和病毒的侵犯有关[6,7]。伤寒、副伤寒散发病例的主要传播途径为污染的食物(特别是海产品)。青壮年作为社会的主要生产力，外出工作就餐的机会多，故接触病原体的机会较多，易患病。总之，应加强对低龄儿童和重点人群的监测和防控，加强食品安全和公共卫生监管、保护易感人群、防止病从口入。

图1 58侏伤寒、副伤寒沙门菌PFGE聚类分析图

3.2PFGE是公认的细菌分子流行病研究的“金标准”，其优势是直接针对整个细菌染色体DNA进行分析，分辨能力强、实验结果稳定、重复性好[8]。北京市伤寒、副伤寒沙门菌的PFGE型别较多且分散，表明患者间菌株的遗传亲缘关系相对较远，流行病学表现为高度散发，无聚集性。近10年来，北京市确实没有伤寒或副伤寒的暴发疫情[1]。但在2018年夏天，通过北京市肠道门诊病例监测，发现某区环建公司工人集体去外地劳务支援，时隔一个月后回京陆续发病，引起伤寒输入性暴发，共分离到9株伤寒沙门菌，经PFGE图谱分析发现，该起暴发为同一克隆来源。随即展开流调和异地协查，由于是京外感染，空间的阻隔和时间的滞后，很遗憾最终没能追溯到感染来源，但这提出了警示：目前伤寒、副伤寒病例症状越来越不典型，发病周期和潜伏期长、易复发，且存在慢性带菌。虽然流行方式多呈散发，但城市化和全球化对公共卫生的影响越来越大，北京流动人口数量巨大，人口流动会带来传染源输入风险，而且这种风险会持续存在，随时都有暴发的可能，因而要引起广泛关注。

3.3与既往本地区的研究数据相比[9]，伤寒、副伤寒沙门菌对磺胺异噁唑、萘啶酸、链霉素和氨苄西林等经典抗生素耐药率在增加。虽然不同血清型对各种抗生素的耐药率有明显差异，但总体上对阿莫西林克拉维酸、强力霉素、阿奇霉素和亚胺培南所有菌株均敏感。甲型副伤寒沙门菌的耐药率高于伤寒沙门菌和其它两型，这与浙江等地的研究结果一致[10]。值得关注的是，本研究显示甲型副伤寒沙门菌对第1代喹诺酮类药物萘啶酸100%耐药，而氟喹诺类药物环丙沙星的耐药率已上升为57.1%，敏感率只有14.3%，且患者年龄<18岁禁用喹诺酮类药物，临床用药应引起足够重视。临床上儿科常用药大环内酯类的阿奇霉素和第3、4代头孢菌素对各种血清型敏感率都很高，应该是治疗伤寒、副伤寒沙门菌感染的首选药。该地区伤寒、副伤寒菌株耐药率的逐步增高和多重耐药株的出现让人忧虑。抗生素的滥用及不规范使用是导致细菌耐药的一个重要因素，临床上在治疗时，必须了解目前流行的血清型和耐药模式，有针对性的合理选用抗生素，以确保其安全性和疗效。因此，要持续、系统地开展伤寒、副伤寒病原学和耐药监测，以了解该地区沙门菌流行血清型及其相应的耐药性变化规律，为临床治疗提供数据支持。